Шпаргалка по "Микробиологии"

При работе с определителем бактерий Бердж  необходимо в первую очередь разобраться, к какой группе относится данный м.о. Для этого необходимо точно  знать его форму, способность окрашиваться по Граму, наличие спор, подвижность, потребность в кислороде, способность расти на обычных питательных средах.

Внутри группы м.о. дифференцируют по главным тестам. Обычно они внесены в таблицы, по которым можно определить семейство и род бактерий, а затем и вид. К наиболее простым относятся: наличие каталазы, оксидазы, уреазы, восстановление нитратов, образование сероводорода, индола, образование кислоты из сахаров, температурные границы роста, солеустойчивость. 

79) Требования, предъявляемые к питательным средам.

• Содержать источники азота, углерода, неорганические соединения, микроэлементы, факторы роста, витамины.
• Иметь определённую концентрацию ионов водорода (рН). Большинство м.о. способны существовать в нейтральной или слабощелочной среде (рН 7…7,6). Кислотность сред контролируется при помощи универсальных индикаторов или специальных приборов  - рН-метров, и доводится до необходимого уровня с помощью растворов кислот и щелочей.
• Быть стерильным, т.е. не содержать вегетативные и споровые формы микробов.
• Должны быть влажными. Все биохимические процессы происходят с использованием молекул воды, поэтому вода является необходимым компонентом питательных сред. Биохимические процессы прекращаются при отсутствии свободной воды.
• Питательные среды должны быть достаточно прозрачными для того, чтобы можно было различать рост м.о. и наблюдать за изменениями, происходящими в результате их жизнедеятельности.

78) Приготовление питательных  сред.

По консистенции питательные среды бывают жидкие (бульоны), полужидкие и плотные. Для приготовления плотных и полужидких питательных сред используют агар-агар, представляющий собой продукт переработки высушенных морских водорослей и состоящий из полисахаридов. Агар расплавляется при кипячении (100С) и затвердевает при 40…43С. Агар-агар не используется м.о. в качестве питательного вещества и не разлагается продуктами их жизнедеятельности.

Для приготовления  плотных питательных сред в жидкие вносят 2…3% агар-агара. Для получения  полужидких сред – добавляют 0,2-0,8% агар-агара.

В некоторых  случаях в качестве уплотнителя  используют желатин – экстракт, получаемый в результате длительного вываривания костей, сухожилий, хрящей. В питательные среды вносят от 10…20% желатина. Желатин используется некоторыми м.о. в качестве источника питания. В связи с этим желатин используют главным образом для выявления протеолитических свойств м.о.

Искусственные питательные среды готовят из продуктов переработки растений, мяса, молока, печени, витаминов и  т.д.

Синтетические питательные среды готовят путём добавления к дистиллированной воде определённых химически чистых соединений (аминокислот, углеводов, солей, витаминов) в оптимальном для данного микроба количестве.

 

80) Классификация питательных сред.

По  консистенции питательные среды бывают жидкие (бульоны), полужидкие и плотные.

По  происхождению различают натуральные (естественные и искусственные), а также синтетические питательные среды.

1) Естественные пит. среды – продукты животного происхождения (кровь, сыворотка, молоко, желчь) растительного происхождения (овощи, фрукты, злаковые), которые используются для культивирования микроорганизмов без специальной обработки с полным сохранением их естественных свойств.

2) Искусственные  питательные среды готовят из  продуктов переработки растений, мяса, молока, печени, витаминов и т.д.

Искусственные питательные среды по целевому назначению можно подразделить на: простые (универсальные  или общеупотребительные); специальные; элективные (избирательные); дифференциально-диагоностические.

3) Синтетические  питательные среды готовят путём  добавления к дистиллированной  воде определённых химически  чистых соединений (аминокислот,  углеводов, солей, витаминов) в  оптимальном для данного микроба  количестве.

Простые среды способны обеспечить рост большинства м.о. К наиболее распространённым простым питательным средам относят МПБ, МПА и МПЖ. Основой для всех трёх сред является мясная вода, которую готовят из фарша говядины, залитого водой, сваренного, профильтрованного и простерилизованного при 120С.

Специальные среды сконструированы для отдельных  видов м.о., которые нуждаются  в определённых веществам и не могут расти на простых питательных  средах.

Для культивирования  молочнокислых бактерий: цельное  молоко, обезжиренное молоко, гидролизованное  молоко, агар с гидролизованным молоком, молочный агар. Для культивирования плесневых грибов и дрожжей: среда Сабуро, сусло-агар, Чапека. Для анаэробных клостридий: среда Китта-Тароци, глюкозо-кровяной агар по Цейсслеру.

 

81) Классификация питательных  сред по назначению.

По назначению питательные среды делят на универсальные (общего назначения) и специальные.

Питательные среды общего назначения подходят для  выращивания многих видов микроорганизмов  и могут использоваться как основа для специальных питательных  сред. К ним относят мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хоттингера и др.

Специальные среды делят на элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные) и консервирующие (транспортные).

Элективные  среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов. Это обеспечивается либо созданием оптимальных условий (pH, состав среды, концентрация солей) для конкретного вида микроорганизмов (положительная селекция), либо добавление в среду веществ, подавляющих рост других микроорганизмов (отрицательная селекция).

Дифференциально-диагностические  среды предназначены для дифференцировки  микроорганизмов по их ферментативной активности. В состав среды вносят субстрат, к которому определяется отношение микроорганизма, и соответствующие индикаторы.

Консервирующие  среды используются в клинической  практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента  взятия материала до посева, а также  для предотвращения размножения  сопутствующей микрофлоры. 

82) Среды обогащения (накопительные)  и дифференциально-диагностические,  их назначение.

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на обще-употребительных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды получили название обогащенных.

Сывороточный  и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному стерильному питательному агару добавляют дефибринированной  крови или сыворотки крови (лошади, КРС, кролика). Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания.Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогично.Растворы углеводов стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5- 1% к пит. среде.

Дифференциально - диагностические  среды предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. В состав этих сред входит основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге pH среды в результате расщепления субстрата.

Среды Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100мл дист. Воды добавляют 1% пептона, 0,5 г NaCI. Компоненты растворяют, фильтруют, устанавливают pH,добавляют один из углеводов субстратов, агар-агар, а затем индикатора Андрэдэ. Готовую среду разливают по 3мл в пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин.

Среда Энда содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференцировки бактерий, различающихся по способности расщеплять глюкозу.(лактоза, питательный агар, смесь фуксина и безводного сульфита натрия).БГКП, разлагая лактозу, восстанавливают обесцвеченный фуксин, образуя колонии красного цвета.

Среда Левина, по целевому назначению аналогична среде Эндо, но содержит другой индикатор(метиленовая синь и эозин). БГКП  - синие или чёрные колонии.

Агар  Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. На среде Плоскирева эшерихии образуют розовые колонии. 

83) Методы культивирования  аэробов и анаэробов.

Для культивирования  анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его специализированной газовой смесью (или инертными газами) в герметизированных термостатах — анаэростатах.

Основные  методы создания анаэробных условий  для культивирования микроорганизмов.

1.Физический - откачивание воздуха, введение  специальной газовой бескислородной  смеси (чаще- N2— 85%, CO2— 10%, H2—  5%). 2.Химический - применяют химические поглотители кислорода. 3.Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов). 4.Смешанный - используют несколько разных подходов.

Метод Цейсслера  применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин  при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым  маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются — их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

 Метод  Фортнера — посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) — рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга  используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

 Метод  Перетца — в расплавленный  и охлаждённый сахарный агар  вносят культуру бактерий и  заливают под стекло, помещённое  на пробковых палочках(или фрагментах  спичек) в чашку Петри. 

Посев —  один из стационарных методов культивирования микроорганизмов на питательных средах, применяемый для культуральной диагностики в медицинской микробиологии, а также для исследования биохимических и биологических свойств в различных биотехнологических целях. В зависимости от содержания исследуемых бактерий в образце, проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний и определения чистоты культуры). Если в исследуемом материале содержание микроорганизмов незначительное, то посев проводят на жидкие среды обогащения. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

84) Среды для культивирования  анаэробов.

Для общей  среды Вильсона — Блера базой является агар с добавлением глюкозы, сульфита натрия и двуххлористого железа. Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид — аниона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии, появляются в глубине агарового столбика.[8]

Среда Китт — Тароцци состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода. 

77) Стерилизация и  пастеризация. Методы  стерилизации.