Шпаргалка по "Микробиологии"

85) Методы выделения  чистой культуры  м.о.

Чистая  культура – популяция м.о., содержащая клетки одного вида и выращенная на искусственных питательных средах при определённых условиях.

Метод Пастера, или метод разбавлений. Из суспензий, содержащей смесь м.о., делается ряд последовательных разведений в стерильной среде (физиологический раствор, питательный бульон). С каждым разведением количество микробных клеток будет уменьшаться и можно получить такие разведения, в которых будет находиться только одна клетка, которая даёт начало чистой культуре.

Метод Коха. Исследуемый материал вносят бактериологической петлёй или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным и охлаждённым до 45С МПА или МПЖ, равномерно размешивают, вращая пробирку между ладонями. Каплю из этого разведения переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, оставляют для застывания среды, а затем помещают в термостат вверх дном во избежание осаждения конденсата. При посеве м.о. на плотную среду они размножаются только на том месте, куда попали первоначально. Из каждой жизнеспособной клетки образуется видимое невооружённым глазом скопление м.о. – колония.

Метод Дригальского. Основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды. Для посева по этому методу используют чашки Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего м.о. Затем с помощью петли каплю растирают по всей поверхности среды. Этим же шпателем проводят по поверхности среды во второй и третьей чашках, в результате чего микробные клетки разделяются. После инкубации в первой чашке наблюдается рост в виде сплошного налёта. В следующих чашках количество становится меньше, и встречаются отдельно расположенные колонии, которые можно изолировать.

Метод нагревания исследуемого материала применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (бацилл, клостридий). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при 80-90С в течение 10…20 мин. При термической обработке вегетативные формы м.о. погибают, а споры остаются живыми и при последующих высевах на плотную среду прорастают, формируя колонии.

Химический  метод используется при изолировании культур м.о., устойчивых к определённым химическим веществам. Исследуемый материал перед посевом заливают 15% р-ром кислоты и выдерживают в термостате 3…4ч. После воздействия кислоты или щелочи клетки возбудителя туберкулёза остаются живыми, а все другие м.о. погибают. После нейтрализации кислоты или щёлочи, материал высеивают на плотную питательную среду, на которой вырастает только возбудитель туберкулёза.

Метод Шукевича используется для выделения подвижных м.о. Делают посев в конденсационную жидкость скошенного МПА. Через несколько часов инкубации подвижные бактерии ( протеи) поднимаются вверх по поверхности среды, образуя налёт.

Биологический метод основан на заражении лабораторных животных. 

86) Основные формы  бактерий.

Были описаны  Левенгуком. Различают 3: шаровидные, палочковидные и извитые

Шаровидные  бактерии (кокки) имеют более или менее правильную круглую, овальную или ланцетовидную форму. Диаметр кокков не превышает 2 мкм. В зависимости от характера деления и прочности сцепления кокки подразделяют на: 1) микрококки – клетки располагаются по одной или беспорядочно; 2) диплококки  - клетки после деления не расходятся и образуют пары (возбудитель пневмонии); 3) стрептококки – клетки делятся в одной плоскости и располагаются цепочками (молочнокислые стрептококки); 4) тетракокки – клетки делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, образуя скопления из четырёх клеток; 5) сарцины – клетки делятся в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях, образуя скопления по 8, 16, 32 и более клеток в виде «пакетов»; 6) стафилококки – клетки делятся беспорядочно в различных плоскостях, образуя скопления, напоминающие виноградные гроздья ( возбудители пищевых токсикозов).

Палочковидные (цилиндрические) бактерии имеют вытянутую форму, различаются по величине, форме и расположению клеток. Длина палочковидных бактерий варьирует от 2…5 до 10…12 мкм. Различным бывает соотношение длины и ширины клеток. Концы могут быть ровными, закруглёнными, заострёнными. Могут располагаться по одной. Попарно, образовывать цепочки. Некоторые бактерии могут образовывать споры, которые служат для переживания неблагоприятных внешних условий( высоких и низких температур, высушивания, воздействия химических веществ). Делятся на группы: 1) собственно бактерии – не образуют спор (кишечная, чудейная палочки, сальмонелла, молочнокислые палочки); 2) бациллы – образуют споры, которые не изменяют форму клетки (сенная, картофельная, капустная бациллы). Бациллы развиваются в присутствии кислорода; 3) клостридии – образуют крупные споры, деформирующие клетку, которая принимает форму веретена, теннисной ракетки, булавы, барабанной палочки (возбудители ботулизма, столбняка, а также порчи пищевых продуктов). Клостридии растут  и размножаются в бескислородной среде.

Извитые (спиралевидные) бактерии имеют один или несколько изгибов. К этой группе относятся: 1) вибрионы – слегка изогнутые клетки в виде запятой, они подвижны за счёт жгутика (холерный вибрион); 2) спириллы имеют несколько спиралевидных завитков (возбудители кариеса, кампилобактерии); 3) спирохеты – очень тонкте длинные спиралевидные формы с большим количеством витков спирали (возбудители инфекционной желтухи, сифилиса).

Помимо этих основных форм существуют нитевидные бактерии – это многоклеточные колониальные организмы, не имеющие функционального разделения между клетками. 

87) Изучение морфологических  свойств выделенной  культуры бактерий.

Выполняем посев исследуемого материала по методу Дригальского на МПА в чашках Петри. Для этого на поверхность  МПА наносим каплю смеси при  помощи профламбированной бактериологической петли. Распределяем каплю по поверхности шпателем. Затем этим же шпателем, не обжигая его, проводят по поверхности среды во второй чашке Петри, в третьей и т.д. Посевы инкубируют при температуре 37С в термостате в течение 3 дней. В результате на поверхности МПА образуются колонии – потомство одной клетки, образующие видимые скопления на плотной питательной среде.

С целью  изучения морфологических свойств, бактериальную массу из одной  колонии берут петлёй, предварительно хорошо профламбированной и охлаждённой, и переносят в пробирку с МПБ. Одновременно делаем мазок на предметном столе и окрашиваем его по методу Грама и микроскопируем. Посевы инкубируем при 37С в термостате.

Микроскопия мазка позволяет определить форму  бактериальной клетки, наличие спор, иногда капсул (морфологические свойства), а также способность окрашиваться по методу Грама (тинкториальные свойства). Кроме того выявляем, состоит ли данная колония и м.о. одного вида или нескольких. 

88) Изучение культуральных  свойств выделенной культуры.

Выполняем посев исследуемого материала по методу Дригальского на МПА в чашках Петри. Для этого на поверхность  МПА наносим каплю смеси при  помощи профламбированной бактериологической петли. Распределяем каплю по поверхности  шпателем. Затем этим же шпателем, не обжигая его, проводят по поверхности среды во второй чашке Петри, в третьей и т.д. Посевы инкубируют при температуре 37С в термостате в течение 3 дней. В результате на поверхности МПА образуются колонии – потомство одной клетки, образующие видимые скопления на плотной питательной среде.

С целью  изучения культуральных свойств, колонии  сначала рассматривают невооружённым  глазом, а затем  с помощью бинокулярной лупы.

Отмечают  следующие культуральные признаки:

Размер  колоний (диаметр в мм). Размер колоний определяют измерением при помощи линейки со стороны дна чашки Петри. Если диаметр колонии < 1мм, то их называют точечными, 1…2 мм – мелкими, 2…4 мм – средними, 4…6 мм – крупными, более 10 мм – очень большими.

Форма колоний бывает правильной (округлой, эллипсоидной) и неправильной (мицеливидной, амёбовидной, листовидной, веретеновидной и т.д.).

Цвет  колоний может быть белым, желтым, розовым, зелёным и т.д. Окрашивание колоний связано со способностью бактерий вырабатывать пигмент.

Поверхность колоний может быть гладкой, складчатой, шероховатой, бугристой и др.

Рельеф  колоний бывает плоским, выпуклым, с вогнутым центром, кратерообразным и др.

Оптический  свойства – колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными, блестящими, матовыми.

Консистенция  колоний может быть мазеобразной, слизистой, сухой, вязкой, плёнчатой

Край  колоний бывает ровным, извилистым. Зубчатым, волнистым, бахромчатым, локонообразным.

Структура колоний может быть гомогенной, неоднородной, грубозернистой, волокнистой и т.д.

Описываются колонии достаточно изолированные  друг от друга. 

89) Изучение биохимических  свойств выделенной  культуры.

Выполняем посев исследуемого материала по методу Дригальского на МПА в чашках Петри. Для этого на поверхность  МПА наносим каплю смеси при помощи профламбированной бактериологической петли. Распределяем каплю по поверхности шпателем. Затем этим же шпателем, не обжигая его, проводят по поверхности среды во второй чашке Петри, в третьей и т.д. Посевы инкубируют при температуре 37С в термостате в течение 3 дней. В результате на поверхности МПА образуются колонии – потомство одной клетки, образующие видимые скопления на плотной питательной среде.

Бактериальную массу из одной колонии берут  петлёй, предварительно хорошо профламбированной и охлаждённой, и переносят в пробирку с МПБ. При изучении особенностей роста на на МПБ обращают внимание на следующие показатели: степень помутнения, наличие пристеночного кольца, наличие поверхностоной плёнки, наличие осадка, наличие цвета.

Для дальнейшей работы удостоверяемся что культура является чистой: делаем мазок, окрашиваем по Граму и микроскопируем. Если обнаруживаем бактериальные клетки, одинаковые по форме и исходной колонией, то культура – чистая. Чистую культуру используют для изучения ферментативных свойств.

Сахаролитическую  способность определяют по ферментативному расщеплению углеводов на кислоты, альдегиды и газообразные продукты (СО2, Н2, СН4). Чаще всего используют полужидкие среды Гисса (основа - пептонная вода, к которой добавлен моноуглевод: лактоза, глюкоза, сахароза), агар-агар, и индикатор (например фуксин), которые обесцвечены щёлочью или розоловой кислотой.

Если углевод  расщепляется под действием ферментов  бактерий, то образуется органическая кислота, которая нейтрализует щёлочь или розоловую кислоту. В результате цвет индикатора восстанавливается и среда окрашивается в розовый (фуксин) или голубой (водно-голубой индикатор). Если углевод расщепляется до конечных продуктов (газов и воды), то наличие газа обнаруживают в виде пузырьков.

Протеолитические  свойства. Протеазы расщепляют белки до пептонов, полипептидов, аминокислот. Некоторые способны расщеплять аминокислоты до индола, сероводорода, аммиака. 

Определение желатиназы. Наблюдается разжижение столбика желатина.

Определение казеиназы. При наличии фермента казеиназы м.о. вызывают пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается растворением сгустка казеина, выпадением осадка и появлением молочной сыворотки.

Тест  на индол. Образование индола определяют по способности м.о. расщеплять триптофан с помощью фермента. Индол обнаруживают с помощью реактивов Эрлиха или Ковача, которые добавляют в бульонную культуру. При наличии индола на границе появляется малиновое кольцо.

Тест  на сероводород. Для обнаружения используют индикаторные бумажки, пропитанные раствором ацетата свинца, которые в положительном случае окрашиваются в чёрный цвет вследствие образования сульфита свинца.

Тест  на аммиак. Для этого под пробку с бульонной культурой помещают розовую лакмусовую индикаторную бумажку, инкубируют в течение 1…5 суток. В положительном случае лакмусовая бумажка приобретает синюю окраску. 

52) Определение общего  количества м.о.  в воде.

Для этого  делаем посевы в чашках Петри.

Микробное число – количество колоний м.о., выросших на МПА при температуре культивирования 37С в течение 24 ч из 1 мл воды. Поскольку подсчитывают не число клеток, а количество видимых невооружённым глазом колоний, то данный показатель называют КОЕ – колониеобразующие единицы. Однако этот показатель учитывает не все м.о., содержащиеся в 1 мл воды, а только мезофильные, аэробные и факультативно-анаэробные, которые способны расти на простых питательных средах.(КМАФАнМ). 
 
 
 
 
 

90) Определение вида  бактерий.

Все данные по изучению биологических свойств  записывают в таблицу. После заполнения таблицы приступают к определению вида микроорганизма. Идентификацию проводят с помощью «Определителя бактерий Берджи», предназначенного для идентификации бактерий по фенотипическим признакам. В нём все прокариотические м.о. объединены в царство прокариотов, которое подразделяется на отделы, классы, порядки, семейства, роды, виды.