Лекции по "Биологии"

Фосфофруктокиназа (ФФК) — это тетрамерный фермент, существующий поочерёдно в двух конформационных состояниях (R и T), которые находятся в равновесии и попеременно переходят из одного в другое. АТФ является одновременно и субстратом, и аллостерическим ингибитором ФФК.

В каждой из субъединиц ФФК имеется  по два центра связывания АТФ: субстратный  сайт и сайт ингибирования. Субстратный  сайт одинаково способен присоединять АТФ при любой конформации  тетрамера. В то время как сайт ингибирования связывает АТФ исключительно, когда фермент находится в конформационном состоянии T. Другим субстратом ФФК является фруктозо-6-фосфат, который присоединяется к ферменту предпочтительно в R-состоянии. При высокой концентрации АТФ сайт ингибирования занимается, переходы между конформациями фермента становятся невозможными, и большинство молекул фермента оказываются стабилизированными в T-состоянии, неспособном присоединить Ф-6-Ф. Однако ингибирование фосфофруктокиназы АТФ подавляется АМФ, который присоединяется к R-конформациям фермента, стабилизируя таким образом состояние фермента для связывания Ф-6-Ф.

Наиболее важным же аллостерическим  регулятором гликолиза и глюконеогенеза является фруктозо-2,6-бифосфат, который не является промежуточным звеном этих циклов. Фруктозо-2,6-бифосфат аллостерически активирует фосфофруктокиназу.

Синтез фруктозо-2,6-бифосфата катализируется особым бифункциональным ферментом — фосфофруктокиназой-2/фруктозо-2,6-бифосфатазой (ФФК-2/Ф-2,6-БФаза). В нефосфорилированной форме белок известен как фосфофруктокиназа-2 и имеет каталитическую активность по отношению к фруктозо-6-фосфату, синтезируя фруктозо-2-6-бифосфат. В результате чего значительно стимулируется активность ФФК и сильно ингибируется активность фруктозо-1,6-бифосфатазы. То есть при условии активности ФФК-2 равновесие этой реакции между гликолизом и глюконеогенезом смещается в сторону первого — синтезируется фруктозо-1,6-бифосфат.

В фосфорилированном виде бифункциональный фермент не обладает киназной активностью, а наоборот в его молекуле активируется сайт, который гидролизует Ф2,6БФ на Ф6Ф и неорганический фосфат. Метаболический эффект фосфорилирования бифункционального фермента состоит в том, что аллостерическая стимуляция ФФК прекращается, аллостерическое ингибирование Ф-1,6-БФазы ликвидируется и равновесие смещается в сторону глюконеогенеза. Продуцируется Ф6Ф и затем — глюкоза.

Взаимопревращения бифункционального  фермента осуществляются цАМФ-зависимой  протеинкиназой (ПК), которая в свою очередь регулируется циркулирующими в крови пептидными гормонами.

Когда в крови снижается концентрация глюкозы, тормозится также и образование инсулина, а выделение глюкагона напротив стимулируется, и его концентрация в крови резко повышается. Глюкагон (и другие контринсулярные гормоны) связываются с рецепторами плазматической мембраны клеток печени, вызывая активацию мембранной аденилатциклазы. Аденилатциклаза катализирует превращение АТФ в циклический АМФ. цАМФ связывается с регуляторной субъединицей протеинкиназы, вызывая высвобождение и активизацию её каталитических субъединиц, которые фосфорилирует ряд ферментов, включая и бифункциональную ФФК-2/Ф-2,6-БФазу. При этом в печени прекращается потребление глюкозы и активизируются глюконеогенез и гликогенолиз, восстанавливая нормогликемию.

Пируваткиназа

Следующим шагом, где осуществляется регуляция гликолиза, является последняя  реакция — этап действия пируваткиназы. Для пируваткиназы также описан ряд изоферментов, имеющих особенности регуляции.

Печёночная пируваткиназа (L-тип) регулируется при фосфорилировании, аллстерическими эффекторами и путём регуляции экспрессии генов. Фермент ингибируется АТФ и ацетил-КоА и активируется фруктозо-1,6-бифосфатом. Ингибирование пируваткиназы АТФ происходит подобно действию АТФ на ФФК. Связывание АТФ с сайтом ингибирования фермента уменьшает его сродство к фосфоенолпирувату. Печёночная пируваткиназа фосфорилируется и ингибируется протеинкиназой, и таким образом также находится под гормональным контролем. Кроме того, активность печёночной пируваткиназы регулируется и количественно, то есть изменением уровня его синтеза. Это медленная, долговременная регуляция. Увеличение в рационе углеводов стимулирует экспрессию генов, кодирующих пируваткиназу, в результате уровень фермента в клетке повышается.

М-тип пируваткиназы, найденный в головном мозге, мышцах и других глюкозо-потребных тканях не регулируется протеинкиназой. Это принципиально в том, что метаболизм этих тканей определяется только внутренними потребностями и не зависит от уровня глюкозы в крови.

Мышечная пируваткиназа не подвержена внешним влияниям, таким как понижение уровня глюкозы в крови или выброс гормонов. Внеклеточные условия, которые приводят к фосфорилированию и ингибированию печёночного изофермента, не изменяют активность пируваткиназы М-типа. То есть интенсивность гликолиза в поперечнополосатой мускулатуре определяется только условиями внутри клетки и не зависит от общей регуляции.

Значение

Гликолиз — катаболический путь исключительной важности. Он обеспечивает энергией клеточные реакции, в том числе и синтез белка. Промежуточные продукты гликолиза используются при синтезе жиров. Пируват также может быть использован для синтеза аланина, аспартата и других соединений. Благодаря гликолизу производительность митохондрий и доступность кислорода не ограничивают мощность мышц при кратковременных предельных нагрузках.

Цикл трикарбоновых  кислот (цикл Кребса, цитратный цикл) — центральная часть общего пути катаболизма, циклический биохимический аэробный процесс, в ходе которого происходит превращение двух- и трёхуглеродных соединений, образующихся как промежуточные продукты в живых организмах при распаде углеводов, жиров и белков, до CO₂. При этом освобождённый водород направляется в цепь тканевого дыхания, где в дальнейшем окисляется до воды, принимая непосредственное участие в синтезе универсального источника энергии — АТФ.

Цикл Кребса — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме. Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.

Цикл превращения лимонной кислоты в живых клетках был открыт и изучен немецким биохимиком Гансом Кребсом, за эту свою работу он (совместно с Ф. Липманом) был удостоен Нобелевской премии (1953 год).

У эукариотов все реакции цикла Кребса протекают внутри митохондрий, причём катализирующие их ферменты, кроме одного, находятся в свободном состоянии в митохондриальном матриксе, исключение составляет сукцинатдегидрогеназа, которая локализуется на внутренней митохондриальной мембране, встраиваясь в липидный бислой. У прокариот реакции цикла протекают в цитоплазме.

[править] Стадии цикла Кребса

Общее уравнение одного оборота  цикла Кребса:

Ацетил-КоА → 2CO₂ + КоА + 8e⁻

ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

ЦТК можно рассматривать как  выработанный клеткой механизм, имеющий  двоякое назначение. Основная функция  его заключается в том, что  это совершенный клеточный "котел", в котором осуществляется полное окисление вовлекаемого в него органического субстрата и отщепление водорода. Другая функция цикла — снабжение клетки рядом предшественников для биосинтетических процессов. Обычно ЦТК является дальнейшей "надстройкой" над анаэробными энергетическими механизмами клетки. Исходным субстратом ЦТК служит ацетил-КоА ("активированная уксусная кислота"), образующийся у аэробов из пирувата в реакции, осуществляемой пируватдегидрогеназным комплексом:

CH₃-CO-COOH + КоA-SH + НАД⁺ ® CH₃-CO~S-КоA + НАД-H² + CO₂

Собственно ЦТК (рис. 92) начинается с конденсации ацетил-КоА с молекулой щавелевоуксусной кислоты, катализируемой цитратсинтазой. Продуктами реакции являются лимонная кислота и свободный кофермент А. Лимонная кислота с помощью фермента аконитазы последовательно превращается в цис-аконитовую и изолимонную кислоты. Последняя превращается в a-кетоглутаровую кислоту в реакции, катализируемой изоцитратдегидрогеназой. H₂ первом этапе реакции имеет место дегидрирование изолимонной кислоты, в результате которого образуется щавелевоянтарная кислота и НАД-H₂. На втором этапе щавелевоянтарная кислота, все еще, вероятно, связанная с ферментом, подвергается декарбоксилированию. Продукты реакции — a-кетоглутаровая кислота, освобождающаяся от фермента, и CO₂.

a-кетоглутаровая кислота подвергается далее окислительному декарбоксилированию, катализируемому a-кетоглутаратдегидрогеназным комплексом, в результате чего образуется сукцинил-КоА. Эта реакция — единственная необратимая реакция из десяти, составляющих ЦТК. Один из продуктов реакции — сукцинил-КоА — представляет собой соединение, содержащее высокоэнергетическую тиоэфирную связь.

Следующий этап — образование янтарной кислоты  из сукцинил-КоА, катализируемое сукцинилтиокиназой, в результате которого энергия, освобождающаяся  при разрыве тиоэфирной связи, запасается в фосфатной связи ГТФ. ГТФ  затем отдает свою фосфатную группу молекуле АДФ, что приводит к образованию АТФ. Следовательно, на данном этапе ЦТК имеет место субстратное фосфорилирование.

Янтарная кислота окисляется в  фумаровую с помощью фермента сукцинатдегидрогеназы. Далее фумаровая  кислота гид-ратируется под действием фумаразы, в результате чего возникает яблочная кислота, которая подвергается дегидрированию, приводящему к образованию ЩУК. Реакция катализируется НАД-зависимой малатдегидрогеназой. Этой реакцией завершается ЦТК, так как вновь регенерируется молекула-акцептор (ЩУК), запускающая следующий оборот цикла. Однако поскольку из цикла происходит постоянный отток для биосинтезов промежуточных метаболитов, приводящий к понижению уровня ЩУК, возникает необходимость в ее дополнительном синтезе. Это обеспечивается как в реакциях карбоксилирования пирувата или фосфоенолпирувата (см. табл. 24), так и с помощью последовательности из двух реакций, получивших название глиоксилатного шунта (рис. 92). В первой из них изолимонная кислота под действием изоцитратлиазы расщепляется на янтарную и глиоксиловую кислоты. Во второй реакции, катализируемой малатсинтетазой, глиоксиловая кислота конденсируется с ацетил-КоА с образованием яблочной кислоты, превращающейся далее в ЩУК. В результате двух новых реакций происходит синтез C₄-кислоты из двух C₂-остатков. Глиоксилатный шунт не работает при выращивании на субстратах, катаболизирование которых приводит к образованию пировиног-радной кислоты. Он включается при выращивании организмов на C₂-соединениях.

Энергетическим "топливом", перерабатываемым в ЦТК, служат не только углеводы, но и жирные кислоты (после предварительной  деградации до ацетил-КоА), а также многие аминокислоты (после удаления аминогруппы в реакциях дезамини-рования или переаминирования). В результате одного оборота цикла происходят 2 декарбоксилирования, 4 дегидрирования и 1 фосфорилирование. Итогом 2 декарбоксилирований является выведение из цикла 2 атомов углерода (2 молекулы CO₂), т. е. ровно столько, сколько его поступило в виде ацетильной группы. В результате 4 дегидрировании образуются 3 молекулы НАД-H₂ и 1 молекула ФАД-H₂. Как можно видеть, в процессе описанных выше превращений весь водород оказывается на определенных переносчиках и задача теперь — передать его через другие переносчики на молекулярный кислород.

Как представлено это у эубактерий? С определенными последовательностями ферментативных реакций, аналогичных тем, которые имеют место в ЦТК, мы встречаемся у эубактерий, находящихся на разных этапах эволюционного развития. Некоторые реакции цикла функционируют в анаэробных условиях у бактерий, получающих энергию в процессах брожения.