Контрольная работа по "Биологии"

 

Гетерогенный катализатор  легко отделим от реакционной  среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

Ферментативный процесс  с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

Модификация фермента целенаправленно  изменяет его свойства, такие как  специфичность (особенно в отношении  макромолекулярного субстрата), зависимость  каталитической активности от рН, ионного  состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов  путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких  как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так  и путем внутримолекулярной или  межмолекулярной сшивки белковых молекул  низкомолекулярными бифункциональными  соединениями, а также путем присоединения 

3. К носителям предъявляются  следующие требования (Дж.Порат, 1974):

- высокая химическая и  биологическая стойкость; 

- высокая химическая прочность; 

- достаточная проницаемость  для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность; 

- возможность получения  удобных в технологическом отношении  форм (гранул, мембран);

- легкая активация; 

- высокая гидрофильность;

- невысокая стоимость. 31

4. Классификация носителей  для иммобилизованных ферментов 

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные.

Синтетические полимеры также  можно разделить на группы в связи  с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

5. Наиболее часто для  иммобилизации используются такие  полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Для  увеличения механической прочности  целлюлозу гранулируют путем  частичного гидролиза, в результате  которого разрушаются аморфные  участки. На их место для  сохранения пористости между  кристаллическими участками вводят  химические сшивки. Гранулированную  целлюлозу довольно легко превратить  в различные ионообменные производные,  такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ  и т.д. 

Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под  названием "сефадексы". При высушивании  они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях  размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят  и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению  к ферментам, гидролизу.

6. Хорошим носителем считается  агар. Его свойства улучшаются  после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой  агар становится устойчивым к  нагреванию, прочен, легко модифицируется.

7. Белки в качестве  носителей обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации,  могут применяться в качестве  тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию  ферментов на белковых носителях  можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих  агентов. К недостаткам белков  в качестве носителей относят  их высокую иммуногенность (за  исключением коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки. 32

Ответ к задаче № 11.

1. В пищевой промышленности  с участием иммобилизованных  ферментов идут процессы получения  глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы,  яблочной и аспарагиновой кислоты,  оптически активных L- аминокислот,  диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки  и др.

2. В медицине иммобилизованные  ферменты открыли путь к созданию  лекарственных препаратов пролонгированного  действия со сниженной токсичностью  и аллергенностью. Иммобилизационные  подходы способствуют решению  проблемы направленного транспорта  лекарств в организме. В медицине  иммобилизованные ферменты используются  также как лекарственные препараты,  особенно в тех случаях, когда  необходимо локальное воздействие.  Кроме того, биокатализаторы широко  используются в различных аппаратах  для перфузионной очистки различных  биологических жидкостей. Возможности  и перспективы использования  в медицине ферментов в иммобилизованном  состоянии гораздо шире, чем достигнутые  на сегодняшний день, именно на  этом пути медицину ждет создание  новых высокоэффективных методов  лечения. 

3. Иммобилизованные клетки  имеют ряд преимуществ, как  перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками:

- отсутствие затрат на  выделение и очистку ферментов; 

- снижение затрат на  выделение и очистку продуктов  реакции; 

- более высокая активность  и стабильность;

- возможность создания  непрерывных и полунепрерывных  автоматизированных процессов; 

- способность к длительному  функционированию полиферментных  систем без экзогенных кофакторов.

4. Для иммобилизации могут  быть использованы клетки в  различном состоянии: живые и  поврежденные в различной степени.  Одностадийные реакции могут  осуществлять и живые, и поврежденные  клетки. Полиферментные реакции  проводят с применением живых  клеток, которые могут длительное  время регенерировать АТФ и  коферменты (НАДФ, НАД).

Иммобилизовать можно  не только клетки микроорганизмов, но и клетки растительных и животных тканей, используя их для синтеза  физиологически активных соединений. Интересные возможность открываются и при иммобилизации клеточных органелл как активных полиферментных систем. Все это свидетельствует о перспективности развития одного из направлений биотехнологии, связанного с изучением и применением иммобилизованных клеток.

5. Химический метод основан  на образовании ковалентных связей  с активированным носителем, на  поперечной сшивке клеток за  счет активных групп в клеточной оболочке с бифункциональными реагентами (например, глутаровым альдегидом)

К физическим методам относятся  адсорбция и агрегация. 33

Иммобилизация клеток путем  включения в различные гели, мембраны, волокна основана на химических и  физических взаимодействиях. Химические методы используются реже по сравнению  с другими методами и малопригодны для иммобилизации живых клеток. Гораздо большее распространение  получило включение клеток в состав гелей, мембран и волокон. При  таком способе иммобилизации  клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной  среды размножаться в приповерхностных слоях гелей.

Ответ к задаче № 12.

1. Наиболее распространенным  методом генной инженерии является  метод получения рекомбинантных  плазмид, которые представляют  собой кольцевые, двухцепочечные  молекулы ДНК, состоящие из  нескольких пар нуклеотидов. Каждая  бактерия помимо основной, не  покидающей клетку молекулы ДНК  (5*106 пар нуклеотидов), может содержать  несколько различных плазмид,  которыми она обменивается с  другими бактериями. Плазмиды являются  автономными генетическими элементами, реплицирующимися в бактериальной  клетке не в то же время,  что основная молекула ДНК.  Плазмиды несут важные для  бактерии гены, как гены лекарственной  устойчивости. Разные плазмиды содержат  разные гены устойчивости к  антибактериальным препаратам. При  действии определѐнного антибиотика  на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди  бактерий, сохраняя им жизнь. 

2. Бактериальные клетки  вырабатывают рестриктазы для  разрушения инородной (фаговой)  ДНК, что необходимо для ограничения  вирусной инфекции. Рестриктазы  узнают определѐнные последовательности  нуклеотидов (сайты – участки  узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг  от друга разрывы в цепях  ДНК на равных расстояниях  от центра сайта. В результате  на концах каждого фрагмента  рестриктированной ДНК образуются  короткие одноцепочечные «хвосты», которые называют липкими концами. 

3. Для получения рекомбинантной  плазмиды ДНК одной из плазмид  расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в  бактериальную клетку, расщепляют  из ДНК хромосом человека с  помощью рестриктазы, поэтому  его «липкие» концы являются  комплементарными нуклеотидным  последовательностям на концах  плазмид. Ферментом лигазой «склеивают»  оба куска ДНК в результате  получается рукомбинантная кольцевоя  плазмида, которую вводят в бактерию, например, E. coli. Все потомки этой  бактерии (клоны) содержат в плазмидах  чужеродный ген. Весь этот процесс  называют клонированием. 

4. В качестве продуцентов  различных рекомбинантных белков  используют:

Escherichia coli (кишечная палочка)- грамотрицательная условно-патогенная  палочка, у которой в настоящее  время детальна изучен геном и механизмы 34

экспрессии генов, имеется  плазмида, так называемый собственный-вектор на основе которой созданы химерные плазмиды, содержащие гены-маркеры устойчивости к антибиотикам.

Bacillus subtilis (сенная палочка) - грамположительный спорообразующий  непатогенный микроорганизм, способный  адсорбировать и поглощать молекулы  ДНК из внешней среды и секретировать  из клеток в культуральную  жидкость большие количества  белков.

Pseudomonas (псевдомонады) - грамотрицательные  условно-патогенные и патогенные  палочки, способные к накоплению  рекомбинантных белков, в отличие  от кишечной палочки, в растворенном  состоянии за счет специфических  окислительно-восстановительных потенциалов  цитоплазмы клеток.

Сахаромицеты (пекарские  дрожжи - Saccaromyces cerevisiae и пивные дрожжи - Saccaromyces carlsbergensis) - эукариотиче-ские клетки, способные к посттрансляционной модификации белков и содержащие 2 микронную дрожжевую плазмиду с  селективным геном-маркером, кодирующим синтез лейцина. Сахаромицеты способны к ферментативной модификации белков и экскреции рекомбинантных продуктов  из клетки. Кроме сахаромицетов используют другие виды дрожжей. Наиболее эффективными продуцентами полноценных белков являются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris и Hansenula pofymorpha, способные использовать метанол  как единственный источник углерода и энергии.

Культуры клеток животной ткани, которые в отличии от культур микроорганизмов, способны осуществлять более детальную модификацию белков. Используются следующие культуры клеток:

культура клеток китайского хомячка CCL-2 (СНО);

МК-2 - культура клеток почки  обезьяны;

HLM- культура клеток печени  эмбриона человека;

LM- культура клеток соединительной  ткани мышц.

5. Вектор - самореплицирующаяся  молекула ДНК ( например, бактериальная плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от организма донора к организму реципиента, а также, для клонирования нуклеотидных последовательностей.

Ответ к задаче №13.

1. Инсулин является полипептидным  гормоном. Общая характеристика  функции инсулина состоит в  том, что в мышцах, печени и  жировой ткани он усиливает  анаболитические и ингибирует  катаболитические процессы. В частности,  инсулин повышает скорость синтеза  гликогена, жирных кислот, белков, а также стимулирует гликолиз. Важное значение имеет стимуляция проникновения глюкозы, ряда других сахаров, а также аминокислот в клетки мышц и жировой ткани. Способствуя входу глюкозы в указанные клетки, гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический эффект). Инсулин ингибирует такие катаболические процессы, как распад гликогена и нейтрального жира. 35

2. Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей: А и В; цепи инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными связями А7-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна дисульфидная связь у А-цепи: А6-А11. Локализация всех трех дисульфидных мостиков постоянна, а А- и В-цепи у представителей большинства видов имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.

3. Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина (молекулярная масса 11500 Da). Молекула проинсулина (молекулярная масса 9000 Da), принимает конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется на инсулин, С-пептид и два дипептида (катионные пары, узнающиеся трипсиноподобным ферментом) и депонируется в секреторных гранулах. Далее содержимое этих гранул секретируется в печеночную вену. Нормальные b-клетки секретируют, помимо инсулина, эквимолярное количество С-пептида. До попадания в периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид попадают в печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не подвергается никаким воздействиям.

4. Можно выделить следующие  недостатки производства и применения  инсулинов из животного сырья:  большой объем производства требует  наличия здоровых животных; сложность  выделения, хранения и транспортировки  сырья; антигенные свойства в  связи с отличием на одну  аминокислоту в свином инсулине; не достигается полная очистка  от проинсулина за исключением  производства высокоочищенных препаратов; наличие чужеродных белков приводит  к образованию антител, формированию  инсулинорезистентности, что выражается  в развитии у больных липодистрофии.