Контрольная работа по "Биологии"

 

1) Выбор гена. На первой  стадии осуществляется выбор  гена с использованием данных  биоинформатики о роли гена  и значении его продукта экспрессии  в метаболизме клетки, а также  структурной и сравнительной  геномики.

2) Амплификация гена. На  втором этапе ДНК выбранного  гена амплифицируют (преумножают)  с помощью полимеразной цепной  реакции (ПЦР) с целью получения  достаточного для дальнейших  исследований количества гена. Наработанная  матрица ДНК подвергается транскрипции  и трансляции в бесклеточной  рибосомно-матричной системе с  целью получения достаточного  количества генного продукта (таргета).

3) Определение специфической  активности таргета в бесклеточной  системе. Природные метаболиты  и синтетические вещества с  антимикробным действием из библиотек  антимикробных агентов испытываются  на способность подавлять активность  таргета. 

4) Выбор антимикробного  агента, обладающего наиболее высокой  аффинностью (избирательностью) к  таргету. 

5) Исследование механизма  взаимодействия отобранного антимикробного  агента с целой микробной клеткой.  Важный этап исследования, так  как на практике антимикробное  вещество может не проникать  в клетку, 25

подвергаться ферментативной инактивации или вступать во взаимодействие с другими макромолекулами клетки.

3. Таргетный скрининг  сформирован как новая стратегия  в области скрининга антагонистов  патогенов и созданием инновационных  антимикробных лекарственных средств,  обладающих принципиально иным  механизмом действия, чем антибиотики,  отбираемые при первичном скрининге  по активности на лабораторных  питательных средах. Отличительной  особенностью новой стратегии  является то, что поисковая работа  начинается не с ингибиторов  того или иного метаболического  процесса патогена, а с возможных  мишеней для потенциальных антимикробных  агентов с применением знаний  о геноме и гене.

4. В дальнейшем значение  конкретного гена для жизнедеятельности  и размножения патогенного микроорганизма  определяется при его трансляции  в живом органе.

Ответ к задаче № 4.

1. Поверхностная и глубинная  ферментация. 

2. Ферментация проходит  в специальных емкостях, называемых  ферментерами или биореакторами.  Основными элементами ферментера  являются двойные стенки, промежуток  между которыми заполняется охлаждающей  или нагревающей жидкостью, входные  отверстия для газовых и жидких  потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

 

3. Технологическое оформление  процессов промышленной биотехнологии  в значительной мере определяется  отношением микроорганизма-продуцента 26

к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста. Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так  как в этом случае необходимо полностью  исключить возможность попадания  кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду.

Биореакторы подразделяют на три основные группы:

1. реакторы с механическим  перемешиванием;

2. барботажные колонны,  через которые для перемешивания  содержимого пропускают воздух;

3. эрлифтные реакторы  с внутренней или внешней циркуляцией;  перемешивание и циркуляция культуральной  среды в них обеспечивается  потоком воздуха, за счет которого  между верхним и нижним слоями  культуральной среды возникает  градиент плотности. 

 

4. Простейшим вариантом  управления стадией ферментации  в периодическом режиме является  изменение концентраций компонентов  среды и еѐ рН, а также введение  необходимых добавок по заранее  разработанной программе, реализуемой  технологом в каждом цикле  ферментации. Важно также поддерживать  определенный состав питательной  среды. В непрерывных процессах  биосинтеза задача технолога  сводится к поддержанию концентрации  всех питательных веществ (и  кислорода) и дозированному введению  кислоты или щелочи для рН-статирования  системы на заданном уровне.

Ответ к задаче № 5.

Последовательность стадий технологического процесса: 10,2, 3, 1, 9, 13,

операции: 5, 4, 7, отделение  экстракта от разрушенных клеток, 8, 11, 6, 12, 14.

Операция «Дезинтеграция (разрушение клеток)» осуществляется при выделении внутриклеточного метаболита (целевого продукта) физическими, химическими, химико-ферментативными  методами в реакторах-дезинтеграторах  с мешалкой, шаровых мельницах, холодильных  установках и т. д.

1.Физические методы: обработка  ультразвуком (с помощью вращающихся  лопастей; продавливанием через  узкое отверстие под давлением;  раздавливанием замороженной клеточной  массы; осмотическим шоком; замораживанием-оттаиванием;  декомпрессией) 27

2.Химические методы: обработка  клеток толуолом, бутанолом. 

3.Химико-ферментативные  методы: обработка клеток грам(-) лизоцимом в присутствии ЭДТА; обработка дрожжей зимолазой; обработка ПАВ; обработка клеток бактерий антибиотиками; заражение бактериофагами.

Ответ к задаче № 6.

1. Общими свойствами ферментов  и небиологических катализаторов  является то, что они: 

катализируют только энергетически  возможные реакции 

никогда не изменяют направления  реакции 

не изменяют равновесия обратимой  реакции, а лишь ускоряют его наступление 

не расходуются в процессе реакции 

 

Но ферменты, как катализаторы биологического происхождения имеют  свои особые свойства:

высокая активность

специфичность (селективность) действия

регулируемая активность в зависимости от условий среды 

катализ реакций в «мягких» условиях

зависимость скорости реакции  от количества фермента

катализируют скорость реакций, принадлежащих к различным классам.

 

2. Активный центр фермента  — высоко специфичный участок молекулы фермента, вступающий в контакт с субстратом в фермент-субстратном комплексе.

Аллостерический центр фермента — участок молекулы фермента, удаленный  от активного центра фермента, активность которого регулируется не субстратами, а другими веществами, но изменения  аллостерического центра ведут к  изменениям в структуре активного  центра фермента.

3. Биообъкты-катализаторы  — биологические объекты на  основе ферментов или мультиферментных  комплексов клеток, катализирующие  процессы биотрансформации и  биокатализа. 

4. Ферменты подразделяют  на 6 групп в зависимости от  катализируемых реакций: 

1. окисление/восстановление (оксиредуктазы) 

2. перенос групп от  одного субстрата к другому  (трансферазы) 

3. гидролиз (гидролазы) 

4. реакции по двойным  связям (разрыв связей и присоединение  к ним химических групп без  присоединения молекулы воды  или окисления) (лиазы) 

5. изомеризация (изомеразы) 

6. синтез сложных соединений (синтетазы или лигазы).

28

Ответ к задаче № 7.

1. Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов.  В первую очередь, к ним относится  генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, другие химические соединения, преобразующие наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды, соблюдения условий культивирования (рН, степень аэрации, терморежим, влажность). При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов  добавляют различные факторы  роста, например, аминокислоты, пуриновые  основания и их производные, РНК  и продукты еѐ гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты  биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут  утилизировать и минеральные  источники азота. В состав питательных  сред входят и ионы MG, Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства  из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.

2. При разработке процесса  биосинтеза a-амилазы культурой Asp.oryzae замена сахарозы (как источника  углерода) на крахмал увеличила  активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта  (из проросших семян злаковых) ещѐ в 10 раз, а повышение  концентрации основных элементов  питательной среды на 50% - ещѐ в  2 раза.

3. Оптимальный состав  питательной среды для каждого  продуцента может быть определен  двумя способами: эмпирический  и построение математической  модели с использованием компьютера.

4. По решению Международного  биохимического союза активность  решено определять при t = 30оС  по начальной скорости реакции,  когда концентрация насыщения  фермента и временная зависимость  близка к кинетике реакции  нулевого порядка. Остальные параметры  реакции индивидуальны для каждого  фермента. Активность ферментного  препарата выражается в микромолях  субстрата, прореагировавшего под  действием 1 мл ферментного раствора  или 1 грамма препарата в оптимальных  условиях за 1 минуту. Если ферментный  препарат не содержит балласта, то его активность выражается  в тех же стандартных единицах  на 1 мг фермента. Если же есть  балласт, то активность считается  на 1 мг белка в ферментном препарате.  Активность выпускаемого препарата  - важнейший нормируемый показатель  качества. 29

5. Основную часть ферментов,  получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. 

Ответ к задаче № 8.

1. При поверхностном методе  культура растет на поверхности  твердой увлажненной питательной  среды. Мицелий полностью обволакивает  частицы субстрата. Поскольку  для дыхания клетки используют  кислород, то среда должна быть  рыхлой, а слой культуры-продуцента  небольшим. 

2. Преимущества поверхностной  культуры: значительно более высокая  конечная концентрация фермента  на единицу массу среды, поверхностная  культура относительно легко  высушивается, легко переводится  в товарную форму. 

3. Посевной материал может  быть трѐх видов:

- культура, выросшая на  твердой питательной среде; 

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

4. Схема очистки сводится  к следующему:

- освобождение от нерастворимых  веществ; 

- освобождение от сопутствующих  растворимых веществ; 

- фракционирование (как правило,  хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят  сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения  и очистки завершает сушка. После  сушки препарат должен содержать  не более 6-8% влаги, тогда он может  в герметичной упаковке храниться  до года без потери активности.

5. Стандартизация ферментного  препарата - доводка активности  фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.

Ответ к задаче № 9.

1. да 

 

биообъект-биокатализатор: ферменты клеток Digitalis lanata

Источник получения: культура клеток Digitalis lanata, которая из-за изменения  типа питания с фотоавтотрофного (у растений) на гетеротрофный (у  культуры клеток) и путей метаболизма  утратила способность образовывать сердечные гликозиды, но сохранила  метаболический путь присоединения  -ОН группы в 12 положении циклопентанпергидрофенантрена.

2. Цели и преимущества  использования иммобилизованных  клеток растений в качестве  биокатализатора в данном процессе: цель — повышение выхода целевого  продукта и времени функционирования  биокатализатора; преимущества: многократное  использование биокатализатора,  четкое отделение биокатализатора  от целевого продукта, увеличение  времени функционирования биокатализатора. 

30

 

3. Реакции, катализируемые  биокатализатором: 12 — дегидроксилирование 

4. Носители для иммобилизации:  кальция альгинат, нейлон, полиуретан 

 

Методы имобилизации биокатализатора: включение в структуру геля

5. Виды биореакторов для процесса с применением иммобилизованного биокатализатора: в зависимости от состояния системы «имобилизизованные клетки — полимер» могут быть использованы биореакторы с циркуляционным перемещиванием гранул и насадкой, с механическим перемешиванием и фильтром, «корзиночного типа» для гранулированной системы, со стимуляцией газообмена для системы в виде геля.

 

Ответ к задаче № 10.

1. Решить эти проблемы  помогает создание в 1916г иммобилизованных  ферментов. 

2. Преимущества иммобилизованных  ферментов перед нативными предшественниками: