Контрольная работа по "Биологии"

1. Гомогенный вид иммуноферментного  анализа. 

2. Прямой конкурентный метод  ELISA для определения антигенов. 

3. Метод последовательного насыщения  ELISA.

4. Метод ингибирования ELISA с использованием  двойных антител. 

5. Прямой конкурентный метод  ELISA для определения антител. 

6. Иммунометрический вид ИФА  («Сендвич»-анализ), его этапы.

 

Задача № 58

Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител  с узкой специфичностью.

1. Какие этапы включает процедура  получения моноклональных антител? 

 

2. Назначение процесса иммунизации  животных при получении моноклональных  антител. 

а. Какие клетки используют для гибридизации in vivo при производстве моноклонольных антител?

 

Задача № 59

Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител  с узкой специфичностью.

1. Иммунизация in vitro при производстве  моноклональных антител, преимущества.

2. Клонирование гибридомных клеток, известные вам методы клонирования.

22

 

3. Принцип работы теста для  ранней диагностики беременности  с помощью моноклональных антител. 

 

Задача № 60

Проанализируйте описание технологического процесса по следующей схеме:

название иммунотропного лекарственного средства;

класс и группа препаратов, к которым  относится данное средство;

достоинства и недостатки данного  иммунотропного средства;

основные этапы получения;

показатели качества;

условия хранения и транспортирования;

влияние на иммунитет и применение.

 

«из плазмы или сыворотки крови  доноров-добровольцев, иммунизированных вакциной против клещевого энцефалита, выделяют фракцию Ig фракционированием  этанолом при температуре ниже 00С глобулиновой части белков крови. Далее про водят лиофилизацию, изготовление 10% раствора, стерилизующую фильтрацию и ампyлирование по 1 мл (1 доза)». 23

ОТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ

Ответ к задаче №1.

1. Антимикробное действие  макролидов обусловлено нарушением  синтеза белка на этапе трансляции  в клетках чувствительных микроорганизмов.  Молекула антибиотика способна  обратимо связываться с каталитическим  пептидил-трансферазным центром  рибосомальной 50S-субъединицы и  вызывать отщепление комплекса  пептидил-тРНК (представляющего собой  растущую пептидную цепь) от рибосомы. В результате приостанавливается  процесс формирования и наращивания  пептидной цепи. Связывание макролидов  с 50S-субъединицей возможно на  любой стадии рибосомального  цикла. 

2. Характер антимикробного  действия макролидов обычно является  бактериостатическим. Тем не менее в определенной степени он зависит от концентрации антибиотика в очаге инфекции, вида микроорганизма, фазы его развития и степени микробной обсемененности. В высоких концентрациях (в 2-4 раза превышающих МПК) и особенно в отношении тех микроорганизмов, которые находятся в фазе роста, макролиды могут оказывать бактерицидное действие. Подобным образом они действуют на -гемолитический стрептококк группы А, пневмококк, менингококк, возбудителей коклюша и дифтерии. В то же время против золотистого стафилококка макролиды в большинстве случаев проявляют бактериостатический эффект.

3. Связывание с 50S-субъединицами  рибосом характерно также для  таких антибиотиков, как линкозамиды,  стрептомицин и хлорамфеникол.  Несмотря на то, что по особенностям  связывания с доменами пептидил-трансферазного  центра данные антибиотики отличаются от макролидов, при одновременном назначении между ними возможна конкуренция и ослабление антимикробного эффекта.

4. В последние годы  значение определения чувствительности  микроорганизмов к макролидным  антибиотикам in vitro возрастает. Современные стандартизированные методы определения чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных разведении (в агаре и бульоне, метод микроразведений) и диффузионные (диско-диффузионный метод и метод Е-тестов). Методы серийных разведении и Е-тесты позволяют получить количественную характеристику чувствительности микроорганизмов - МПК антибиотика в отношении данного возбудителя, а диско-диффузионный метод является полуколичественным и позволяет подразделить все штаммы на три категории - чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные, но при регистрации и анализе диаметра зон он в ряде случаев приближается к количественным методам.

24

Ответ к задаче №2.

1. В результате катаболитной  репрессии генов ферментов биосинтеза  антибиотиков. Катаболитная репрессия  - подавление синтеза определенных  ферментов продуктами катаболизма  глюкозы и других легкоокисляемых  веществ. Применительно к синтезу  антибиотиков глюкоза, фруктоза, сахароза, галактоза являются сильными  репрессорами синтеза ферментов,  ответственных за биосинтез антибиотиков. Данное явление получило название  «глюкозный эффект». 

2. Существуют общие закономерности, которые необходимо учитывать  при культивировании большинства  продуцентов вторичных метаболитов:  углеродкатаболитная регуляция;  содержание фосфатов в среде;  азоткатаболитная регуляция; влияние  первичных метаболитов; влияние  кислорода воздуха. 

3. Медленно утилизируемые  полисахариды, такие как крахмал  более благоприятны для биосинтеза  антибиотиков. Репрессором биосинтеза  не является и лактоза, которая  утилизируется медленно. При гидролизе  лактозы высвобождается глюкоза,  которая репрессирует фермент  р-галактозидазу, в результате  гидролиз лактозы и, следовательно,  появление в среде глюкозы  замедляется. 

 

Ответ к задаче №3.

1. В данном примере  применяется таргетный скрининг.

2. Последовательные этапы  таргетного скрининга: 

 

1) Выбор гена. На первой  стадии осуществляется выбор  гена с использованием данных  биоинформатики о роли гена  и значении его продукта экспрессии  в метаболизме клетки, а также  структурной и сравнительной  геномики.

2) Амплификация гена. На  втором этапе ДНК выбранного  гена амплифицируют (преумножают)  с помощью полимеразной цепной  реакции (ПЦР) с целью получения  достаточного для дальнейших  исследований количества гена. Наработанная  матрица ДНК подвергается транскрипции  и трансляции в бесклеточной  рибосомно-матричной системе с  целью получения достаточного  количества генного продукта (таргета).

3) Определение специфической  активности таргета в бесклеточной  системе. Природные метаболиты  и синтетические вещества с  антимикробным действием из библиотек  антимикробных агентов испытываются  на способность подавлять активность  таргета. 

4) Выбор антимикробного  агента, обладающего наиболее высокой  аффинностью (избирательностью) к  таргету. 

5) Исследование механизма  взаимодействия отобранного антимикробного  агента с целой микробной клеткой.  Важный этап исследования, так  как на практике антимикробное  вещество может не проникать  в клетку, 25

подвергаться ферментативной инактивации или вступать во взаимодействие с другими макромолекулами клетки.

3. Таргетный скрининг  сформирован как новая стратегия  в области скрининга антагонистов  патогенов и созданием инновационных  антимикробных лекарственных средств,  обладающих принципиально иным  механизмом действия, чем антибиотики,  отбираемые при первичном скрининге  по активности на лабораторных  питательных средах. Отличительной  особенностью новой стратегии  является то, что поисковая работа  начинается не с ингибиторов  того или иного метаболического  процесса патогена, а с возможных  мишеней для потенциальных антимикробных  агентов с применением знаний  о геноме и гене.

4. В дальнейшем значение  конкретного гена для жизнедеятельности  и размножения патогенного микроорганизма  определяется при его трансляции  в живом органе.

Ответ к задаче № 4.

1. Поверхностная и глубинная  ферментация. 

2. Ферментация проходит  в специальных емкостях, называемых  ферментерами или биореакторами.  Основными элементами ферментера  являются двойные стенки, промежуток  между которыми заполняется охлаждающей  или нагревающей жидкостью, входные  отверстия для газовых и жидких  потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

 

3. Технологическое оформление  процессов промышленной биотехнологии  в значительной мере определяется  отношением микроорганизма-продуцента 26

к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста. Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так  как в этом случае необходимо полностью  исключить возможность попадания  кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду.

Биореакторы подразделяют на три основные группы:

1. реакторы с механическим  перемешиванием;

2. барботажные колонны,  через которые для перемешивания  содержимого пропускают воздух;

3. эрлифтные реакторы  с внутренней или внешней циркуляцией;  перемешивание и циркуляция культуральной  среды в них обеспечивается  потоком воздуха, за счет которого  между верхним и нижним слоями  культуральной среды возникает  градиент плотности. 

 

4. Простейшим вариантом  управления стадией ферментации  в периодическом режиме является  изменение концентраций компонентов  среды и еѐ рН, а также введение  необходимых добавок по заранее  разработанной программе, реализуемой  технологом в каждом цикле  ферментации. Важно также поддерживать  определенный состав питательной  среды. В непрерывных процессах  биосинтеза задача технолога  сводится к поддержанию концентрации  всех питательных веществ (и  кислорода) и дозированному введению  кислоты или щелочи для рН-статирования  системы на заданном уровне.

Ответ к задаче № 5.

Последовательность стадий технологического процесса: 10,2, 3, 1, 9, 13,

операции: 5, 4, 7, отделение  экстракта от разрушенных клеток, 8, 11, 6, 12, 14.

Операция «Дезинтеграция (разрушение клеток)» осуществляется при выделении внутриклеточного метаболита (целевого продукта) физическими, химическими, химико-ферментативными  методами в реакторах-дезинтеграторах  с мешалкой, шаровых мельницах, холодильных  установках и т. д.

1.Физические методы: обработка  ультразвуком (с помощью вращающихся  лопастей; продавливанием через  узкое отверстие под давлением;  раздавливанием замороженной клеточной  массы; осмотическим шоком; замораживанием-оттаиванием;  декомпрессией) 27

2.Химические методы: обработка  клеток толуолом, бутанолом. 

3.Химико-ферментативные  методы: обработка клеток грам(-) лизоцимом в присутствии ЭДТА; обработка дрожжей зимолазой; обработка ПАВ; обработка клеток бактерий антибиотиками; заражение бактериофагами.

Ответ к задаче № 6.

1. Общими свойствами ферментов  и небиологических катализаторов  является то, что они: 

катализируют только энергетически  возможные реакции 

никогда не изменяют направления  реакции 

не изменяют равновесия обратимой  реакции, а лишь ускоряют его наступление 

не расходуются в процессе реакции 

 

Но ферменты, как катализаторы биологического происхождения имеют  свои особые свойства:

высокая активность

специфичность (селективность) действия

регулируемая активность в зависимости от условий среды 

катализ реакций в «мягких» условиях

зависимость скорости реакции  от количества фермента

катализируют скорость реакций, принадлежащих к различным классам.

 

2. Активный центр фермента  — высоко специфичный участок молекулы фермента, вступающий в контакт с субстратом в фермент-субстратном комплексе.

Аллостерический центр фермента — участок молекулы фермента, удаленный  от активного центра фермента, активность которого регулируется не субстратами, а другими веществами, но изменения  аллостерического центра ведут к  изменениям в структуре активного  центра фермента.

3. Биообъкты-катализаторы  — биологические объекты на  основе ферментов или мультиферментных  комплексов клеток, катализирующие  процессы биотрансформации и  биокатализа. 

4. Ферменты подразделяют  на 6 групп в зависимости от  катализируемых реакций: 

1. окисление/восстановление (оксиредуктазы) 

2. перенос групп от  одного субстрата к другому  (трансферазы) 

3. гидролиз (гидролазы) 

4. реакции по двойным  связям (разрыв связей и присоединение  к ним химических групп без  присоединения молекулы воды  или окисления) (лиазы)