Контрольная работа по "Биологии"

2. Бактериальные клетки  вырабатывают рестриктазы для  разрушения инородной (фаговой)  ДНК, что необходимо для ограничения  вирусной инфекции. Рестриктазы  узнают определѐнные последовательности  нуклеотидов (сайты – участки  узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг  от друга разрывы в цепях  ДНК на равных расстояниях  от центра сайта. В результате  на концах каждого фрагмента  рестриктированной ДНК образуются  короткие одноцепочечные «хвосты», которые называют липкими концами. 

3. Для получения рекомбинантной  плазмиды ДНК одной из плазмид  расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в  бактериальную клетку, расщепляют  из ДНК хромосом человека с  помощью рестриктазы, поэтому  его «липкие» концы являются  комплементарными нуклеотидным  последовательностям на концах  плазмид. Ферментом лигазой «склеивают»  оба куска ДНК в результате  получается рукомбинантная кольцевоя  плазмида, которую вводят в бактерию, например, E. coli. Все потомки этой  бактерии (клоны) содержат в плазмидах  чужеродный ген. Весь этот процесс  называют клонированием. 

4. В качестве продуцентов  различных рекомбинантных белков  используют:

Escherichia coli (кишечная палочка)- грамотрицательная условно-патогенная  палочка, у которой в настоящее  время детальна изучен геном и механизмы 34

экспрессии генов, имеется  плазмида, так называемый собственный-вектор на основе которой созданы химерные плазмиды, содержащие гены-маркеры устойчивости к антибиотикам.

Bacillus subtilis (сенная палочка) - грамположительный спорообразующий  непатогенный микроорганизм, способный  адсорбировать и поглощать молекулы  ДНК из внешней среды и секретировать  из клеток в культуральную  жидкость большие количества  белков.

Pseudomonas (псевдомонады) - грамотрицательные  условно-патогенные и патогенные  палочки, способные к накоплению  рекомбинантных белков, в отличие  от кишечной палочки, в растворенном  состоянии за счет специфических  окислительно-восстановительных потенциалов  цитоплазмы клеток.

Сахаромицеты (пекарские  дрожжи - Saccaromyces cerevisiae и пивные дрожжи - Saccaromyces carlsbergensis) - эукариотиче-ские клетки, способные к посттрансляционной модификации белков и содержащие 2 микронную дрожжевую плазмиду с  селективным геном-маркером, кодирующим синтез лейцина. Сахаромицеты способны к ферментативной модификации белков и экскреции рекомбинантных продуктов  из клетки. Кроме сахаромицетов используют другие виды дрожжей. Наиболее эффективными продуцентами полноценных белков являются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris и Hansenula pofymorpha, способные использовать метанол  как единственный источник углерода и энергии.

Культуры клеток животной ткани, которые в отличии от культур микроорганизмов, способны осуществлять более детальную модификацию белков. Используются следующие культуры клеток:

культура клеток китайского хомячка CCL-2 (СНО);

МК-2 - культура клеток почки  обезьяны;

HLM- культура клеток печени  эмбриона человека;

LM- культура клеток соединительной  ткани мышц.

5. Вектор - самореплицирующаяся  молекула ДНК ( например, бактериальная плазмида), используемая в генной инженерии для переноса генов от организма донора к организму реципиента, а также, для клонирования нуклеотидных последовательностей.

Ответ к задаче №13.

1. Инсулин является полипептидным  гормоном. Общая характеристика  функции инсулина состоит в  том, что в мышцах, печени и  жировой ткани он усиливает  анаболитические и ингибирует  катаболитические процессы. В частности,  инсулин повышает скорость синтеза  гликогена, жирных кислот, белков, а также стимулирует гликолиз. Важное значение имеет стимуляция проникновения глюкозы, ряда других сахаров, а также аминокислот в клетки мышц и жировой ткани. Способствуя входу глюкозы в указанные клетки, гормон снижает ее содержание в крови (так называемый гипогликемический эффект). Инсулин ингибирует такие катаболические процессы, как распад гликогена и нейтрального жира. 35

2. Молекула инсулина - полипептид, состоящий из двух цепей: А и В; цепи инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными связями А7-В7 и А20-В19. Также в молекуле инсулина имеется еще одна дисульфидная связь у А-цепи: А6-А11. Локализация всех трех дисульфидных мостиков постоянна, а А- и В-цепи у представителей большинства видов имеют по 21 и 30 аминокислотных остатков соответственно.

3. Проинсулин синтезируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме b-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы в виде предшественника - препроинсулина (молекулярная масса 11500 Da). Молекула проинсулина (молекулярная масса 9000 Da), принимает конформацию, необходимую для правильного образования дисульфидных мостиков. Затем проинсулин расщепляется на инсулин, С-пептид и два дипептида (катионные пары, узнающиеся трипсиноподобным ферментом) и депонируется в секреторных гранулах. Далее содержимое этих гранул секретируется в печеночную вену. Нормальные b-клетки секретируют, помимо инсулина, эквимолярное количество С-пептида. До попадания в периферическую кровеносную систему, инсулин и С-пептид попадают в печень, где деградирует 50 % инсулина, в то время как С-пептид не подвергается никаким воздействиям.

4. Можно выделить следующие  недостатки производства и применения  инсулинов из животного сырья:  большой объем производства требует  наличия здоровых животных; сложность  выделения, хранения и транспортировки  сырья; антигенные свойства в  связи с отличием на одну  аминокислоту в свином инсулине; не достигается полная очистка  от проинсулина за исключением  производства высокоочищенных препаратов; наличие чужеродных белков приводит  к образованию антител, формированию  инсулинорезистентности, что выражается  в развитии у больных липодистрофии. 

Ответ к задаче № 14.

1. Под рекомбинантными  понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более  фрагментов ДНК, выделенных из  различных биологических источников.

2. Ферменты, применяемые  при конструировании рекомбинантных  ДНК, можно разделить на несколько  групп: 

- ферменты, с помощью которых  получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие  ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты  ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить  изменение структуры концов фрагментов  ДНК. 

3. Контроль качества генно-инженерных  препаратов имеет свои особенности.  Лекарственные средства, полученные  по рекомбинантной технологии, должны  быть тождественны структурам  организма человека и содержать  минимум допустимых примесей  во избежание иммунологических  и аллергических реакций, также  не 36

должны содержать токсинов, пирогенов, что достигается использованием чистого биологического материала  и качественной очисткой готовой  продукции.

Контроль лекарственных  средств рекомбинантных белков проводят по следующим показателям:

а. подлинность и чистота;

б. биологическая активность;

в. апирогенность;

г. отсутствие острой и хронической  токсичности;

д. биологическая и иммунологическая тождественность, которая определяется по стандартным международным образцам, причем стандартный образец всегда используется рекомбинантный.

 

4. В генной инженерии  чужеродные гены клонируют в  так называемых челночных векторах. Эти вектора с одинаковым успехом  реплицируются в клетках нескольких  хозяев. Векторы были получены  комбинацией in vitro фрагментов плазмид. Удобно встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы, обеспечивающие активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена бэта-лактамазы (ген устойчивости к пенициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322).

5. Удобство доставки гена - проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих рецепторные белки, в том числе и антигены, специфичные для тех или иных тканей), то другие характеристики существующих векторных систем - стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках.

Существует два типа генотерапии: заместительная и корректирующая. Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.

При корректирующей терапии  предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность  его еще очень низка.

Ответ к задаче № 15.

1. Получение инсулина  из тканей свиней является  методом полусинтетическим. 

2. В настоящее время  инсулин человека модификацией  свиного инсулина получают синтетико-ферментативным  методом. Свиной инсулин отличается  от инсулина человека одной  заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин  осуществляют путем катализируемого  ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной 37

смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной  группы получают инсулин человека.

3. Преимущества человеческого  генно-инженерного инсулина человека:

а. Улучшение контроля гликемии связанное с отсутствием инактивирования  инсулина под действием антител, циркулирующих в крови, в результате больному нет необходимости увеличивать  дозу,

б. Уменьшение аллергизации, так как инсулин не воспринимается как чужеродный белок.

Ответ к задаче №1.

1. Антимикробное действие  макролидов обусловлено нарушением  синтеза белка на этапе трансляции  в клетках чувствительных микроорганизмов.  Молекула антибиотика способна  обратимо связываться с каталитическим  пептидил-трансферазным центром  рибосомальной 50S-субъединицы и  вызывать отщепление комплекса  пептидил-тРНК (представляющего собой  растущую пептидную цепь) от рибосомы. В результате приостанавливается  процесс формирования и наращивания  пептидной цепи. Связывание макролидов  с 50S-субъединицей возможно на  любой стадии рибосомального  цикла. 

2. Характер антимикробного  действия макролидов обычно является  бактериостатическим. Тем не менее в определенной степени он зависит от концентрации антибиотика в очаге инфекции, вида микроорганизма, фазы его развития и степени микробной обсемененности. В высоких концентрациях (в 2-4 раза превышающих МПК) и особенно в отношении тех микроорганизмов, которые находятся в фазе роста, макролиды могут оказывать бактерицидное действие. Подобным образом они действуют на -гемолитический стрептококк группы А, пневмококк, менингококк, возбудителей коклюша и дифтерии. В то же время против золотистого стафилококка макролиды в большинстве случаев проявляют бактериостатический эффект.

3. Связывание с 50S-субъединицами  рибосом характерно также для  таких антибиотиков, как линкозамиды,  стрептомицин и хлорамфеникол.  Несмотря на то, что по особенностям  связывания с доменами пептидил-трансферазного  центра данные антибиотики отличаются  от макролидов, при одновременном  назначении между ними возможна  конкуренция и ослабление антимикробного  эффекта. 

4. В последние годы  значение определения чувствительности  микроорганизмов к макролидным  антибиотикам in vitro возрастает. Современные стандартизированные методы определения чувствительности к антибиотикам подразделяются на методы серийных разведении (в агаре и бульоне, метод микроразведений) и диффузионные (диско-диффузионный метод и метод Е-тестов). Методы серийных разведении и Е-тесты позволяют получить количественную характеристику чувствительности микроорганизмов - МПК антибиотика в отношении данного возбудителя, а диско-диффузионный метод является полуколичественным и позволяет подразделить все штаммы на три категории - чувствительные, умеренно-резистентные и резистентные, но при регистрации и анализе диаметра зон он в ряде случаев приближается к количественным методам.

24

Ответ к задаче №2.

1. В результате катаболитной  репрессии генов ферментов биосинтеза  антибиотиков. Катаболитная репрессия  - подавление синтеза определенных  ферментов продуктами катаболизма  глюкозы и других легкоокисляемых  веществ. Применительно к синтезу  антибиотиков глюкоза, фруктоза, сахароза, галактоза являются сильными  репрессорами синтеза ферментов,  ответственных за биосинтез антибиотиков. Данное явление получило название  «глюкозный эффект». 

2. Существуют общие закономерности, которые необходимо учитывать  при культивировании большинства  продуцентов вторичных метаболитов:  углеродкатаболитная регуляция;  содержание фосфатов в среде;  азоткатаболитная регуляция; влияние  первичных метаболитов; влияние  кислорода воздуха. 

3. Медленно утилизируемые  полисахариды, такие как крахмал  более благоприятны для биосинтеза  антибиотиков. Репрессором биосинтеза  не является и лактоза, которая  утилизируется медленно. При гидролизе  лактозы высвобождается глюкоза,  которая репрессирует фермент  р-галактозидазу, в результате  гидролиз лактозы и, следовательно,  появление в среде глюкозы  замедляется. 

 

Ответ к задаче №3.

1. В данном примере  применяется таргетный скрининг.

2. Последовательные этапы  таргетного скрининга: