Разделение смесей методами хроматографии

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

Рис. 3. Распределительная хроматография  с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гель-проникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная  хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии  применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные  параметры хроматографического  разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 4).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

VR = tR ^.  F ;

Исправленое время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR' = tR - t0;

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR' = VR - V0;

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k', определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k' = mн / mп;

Величину  k' легко определить по хроматограмме:

Важнейшими  параметрами хроматографического  разделения являются его эффективность  и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 ^. (tR /  1/2)²,

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

Зная  число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний  диаметр зерна сорбента dc, легко  получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/d_c

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности  колонок различных типов, оценивать  качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

,

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов  важным параметром служит также степень разделения RS:

;

Пики  считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные  хроматографические параметры связывает  следующее уравнение для разрешения:

;

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:  
1) химическая природа сорбента; 
2) состав растворителя и его модификаторов; 
3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси; 
4) температура колонки.

Аппаратура  для жидкостной хроматографии.

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис. 5. представлена блок-схема жидкостного  хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 5. Блок-схема жидкостного хроматографа.

Насос (2) предназначен для создания постоянного  потока растворителя. Его конструкция  определяется, прежде всего, рабочим  давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси  разделяемых компонентов в колонку  с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные  трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии  имеют проточную кювету, в которой  происходит непрерывное измерение  какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Регистрирующая (7) система в простейшем случае состоит  из дифференциального усилителя  и самописца. Желательно также наличие  интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером (8), который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря  на неоспоримый приоритет и крупнейший вклад отечественных ученых в мировую хроматографию, положение России в этой области науки и техники не отличается от положения третьестепенной развивающейся страны. Наличие у нас квалифицированных кадров не может компенсировать явную неразвитость приборостроения. Большой ошибкой в свое время был курс на разработку уникальных хроматографических приборов вместо организации массового производства простых и надежных газовых и жидкостных хроматографов, создания мощной производственной базы высокоточной механики, оптики, электроники.

Роль  хроматографии в XX в. нарастала с  заметным ускорением. Пока нет признаков  изменения этой тенденции и в  нынешнем столетии. Конечно, разработка селективных сенсоров, совершенствование  метода прямого инжекционного анализа, а также компьютерная поддержка таких точных методов измерения, как ЯМР и масс-спектрометрия, могут привести к автоматизации массовых рутинных анализов, однако приоритет в прямом разделении сложных смесей и получении высокочистых компонентов надолго останется за хроматографией.  
 
 
 
 
 
 
 
 

Литература 

1. Препаративная жидкостная хроматография / под. ред. Б. Бидлингмейера - М.:Мир, 1990.
2. Стыскин Е.Л., Илинсон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М. : Химия 1986.
3. Вестник Российской Академии наук том 73, № 7, с. 637-646 (2003)