Разделение смесей методами хроматографии

       Из  достижений отечественных ученых в  теории и практике хроматографии  отметим: разработку теории внешнего массообмена (А.А. Жуховицкий, А.Н. Тихонов, Я.Б. Забежинский), вывод уравнения Ван-Димтера с  учетом внешнего массообмена (А.А. Жуховицкий), термодинамическую интерпретацию удерживаемого объема в газовой хроматографии (В.А. Даванков), исследование катализа методом хроматографии (С.З. Рогинский, М.И. Яновский), создание эксклюзионной хроматорафии вирусов (В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвилли), а также теории и практики препаративной хроматографии биологически активных амфотерных соединений (Г.В. Самсонов). Наши исследователи внесли вклад в развитие теории хирального распознавания в энантиоселективной хроматографии (В.А. Даванков) и теории нелинейной хроматографии (Ю.Я. Лебедев), в разработку методов анализа микропримесей с помощью газовой хроматографии с использованием масс-спектрометров (И.А. Ревельский), хлорированных диоксинов в окружающей среде и биопробах (Э.А. Круглов), функциональных групп полимеров хроматографией в критических условиях (А.И. Горшков, В.В. Евреинов, А.А. Горбунов) и в расширение возможностей ионной и ион-парной хроматографии (Ю.А. Золотев, О.А. Шпигун). Необходимо особо упомянуть А.В. Киселева, который, в частности, обнаружил корреляцию удерживания на плоской поверхности графитированной сажи с числом контактов молекулы сорбата на плоскости (рис. 1), а также предложил использовать хроматографию для изучения конфигурации и конформации молекул в газовой фазе, введя понятие хроматоскопии по аналогии со спектроскопией.

       Рис. 1. Хроматограмма разделения пространственных изомеров пергидрофенантрена на капиллярной  набивной колонке

       При температуре 260°С в газохроматографической колонке дольше удерживаются те пространственные изомеры пергидрофенантрена, которые имеют больше точек соприкосновения с плоской поверхностью сорбента - графитированной термической сажей

       В области приборостроения необходимо отметить несколько оригинальных отечественных разработок: хроматотермограф (А.А. Жуховицкий, Н.М. Туркельтауб, А.А. Дацкевич), газовый хроматограф "Луч-1" с фронтально-адсорбционным концентрированием легких примесей (В.И. Калмановекий, А.А. Жуховицкий, Б.К. Крылов, Я.И. Яшин), газовый хроматограф "Сигма" для анализа атмосферы Венеры (В.Н. Ротин, В.Н. Хохлов и др.), электронозахватный детектор (В.И. Калмановекий, В.Г. Шешенин), устройства для хроматомембранного метода концентрирования (Л.Н. Москвин) и газовой экстракции (Г.В. Иоффе, А.Г. Витенберг), микроколоночные жидкостные хроматографы "Милихром" и "Экохром" (С.В. Кузьмин, Л.С. Сандахчиев, М.А. Грачев, Г.И. Барам, М.П. Перельройзен). Оригинальна идея создания поликапиллярных колонок для газовой хроматографии (В.П. Солдатов), когда многие сотни коротких капилляров объединяются в пучок с синхронизированной скоростью перемещения хроматографических зон. Такая система позволяет увеличить хроматографируемую пробу при сохранении высокой эффективности капилляра (рис. 2).

       Рис. 2. Скоростной анализ паров взрывчатых веществ на поликапиллярной колонке  при температуре 170°С

       Поликапиллярная колонка длиной всего 22 см позволяет  за 2.5 минуты обнаружить и идентифицировать следовые количества паров взрывчатых веществ: 1 - 2,6-динитротолуол, 2 - 2.4-динитротолуол. 3 - 2,4,6-тринитротолуол, 4 - 3,4,5-трининитротолуол, 5 - 2.3,4-тринитротолуол, 6 - гексоген. 7 - тетрил

       РАЗВИТИЕ  ТЕОРИИ И МЕТОДОВ  ХРОМАТОГРАФИИ

       Значительные  усилия хроматографистов были направлены на выявление механизмов разделения и описание размывания хроматографических зон в процессе их переноса вдоль  неподвижной фазы. В итоге были получены колонки с эффективностью, близкой к теоретически возможной. Как в газовой, так и в жидкостной хроматографии успех достигнут благодаря уменьшению размера частиц сорбента или переходу к капиллярным вариантам хроматографии, где путь диффузии разделяемых молекул внутри каждой из двух фаз хроматографической системы сокращен до минимума, а поверхность раздела фаз максимально увеличена. В высокоэффективной жидкостной хроматографии заметный скачок был сделан при замене принудительного прокачивания подвижной жидкой фазы (элюента) насосами высокого давления на перемещение жидкости в результате электроосмоса в приложенном к концам капилляра электрическом поле высокого напряжения (электрохроматография).

       Промежуточное положение между жидкостной и  газовой хроматографией заняла сверхкритическая флюидная хроматография. В этом методе коэффициенты диффузии сорбата в сверхкритической двуокиси углерода (давление более 73 атм и температура выше 31.3°С) близки к высоким значениям коэффициентов диффузии в газах, а растворяющая способность флюида двуокиси углерода, особенно в присутствии добавок метанола, примерно такая же, как у органических жидкостей. Сверхкритическая флюидная хроматография обеспечивает высокоэффективное разделение смесей многих веществ, вплоть до олигомерных молекул, причем экологическая безвредность элюента, то есть двуокиси углерода, выгодно отличает этот метод.

       Сейчас  теоретики сосредоточили усилия на решении проблем селективности  разделения. Изучается связь структуры  исследуемых молекул с их удерживанием на сорбентах разной химической природы, разрабатываются многомерные варианты хроматографии, обеспечивающие разделение нескольких тысяч компонентов, предпринимаются попытки создать единую теорию удерживания для газовой, жидкостной и сверхкритической флюидной хроматографии, развивается теоретическое и компьютерное моделирование хроматограмм. В газовой и в высокоэффективной жидкостной хроматографии широко эксплуатируется фактор геометрического соответствия сорбата активным центрам сорбента, как это имеет место в случае применения циклодекстринов краун-эфиров, сорбентов с молекулярными отпечатками, антител, для селективного удерживания желаемых соединений или изомеров. Продолжаются исследования механизма межмолекулярных взаимодействий и удерживания в хроматографии с привлечением современных спектральных методов.

       С конца 60-х годов, когда были осуществлены первые успешные разделения оптических изомеров (энантиомеров) методами газовой  и жидкостной хроматографии, ведет  свое начало энантио-селективная хроматография. За относительно короткий срок разработаны  скоростные методы энантиомерного анализа практически всех классов органических соединений, созданы системы с симулированным подвижным слоем сорбента для многотоннажного разделения рацемических смесей на составляющие их энантиомеры. Успех энантиоселективной хроматографии способствовал бурному развитию асимметрического органического синтеза и энантиоселективного катализа, а также введению нового законодательства в области производства лекарственных препаратов, которые теперь должны исследоваться, а в большинстве случаев и производиться не в виде рацематов, а в индивидуальном энантиомерно-чистом виде.

       Появились новые эффективные хиральные  селекторы для распознания энантиомеров. При участии ахиральных структур минимальное число контактов  с селектором, необходимое для  успешной дискриминации энантиомеров, сокращается с трех до двух (рис. 3).

       Весьма  перспективно использование экспертных систем в описании и оптимизации  хроматографических разделений, включая  оптимизацию градиентного элюирования. Моделирование оказалось особенно полезным при создании препаративной и промышленной хроматографии. Большие нагрузки на сорбент и нелинейность изотерм адсорбции сорбата при высоких концентрациях потребовали разработки основ нелинейной хроматографии.

       Большим достижением является теория хроматографии полимеров в критических условиях, когда сочетаются адсорбционные и эксклюзионные механизмы разделения. Этот режим хроматографии результативен и в колоночном, и в тонкослойном вариантах.

       Рис. 3. Хроматограмма смеси рацемических аминокислот

       Простой адсорбцией гидрофобного хирального селектора (N-гексадецил-L-оксипролина) стандартная  хроматографическая колонка (LiChrosorb RP 18) длиной 10 см превращается в высокоэффективную лигандообменную колонку, количественно разделяющую каждую из шести рацемических аминокислот пробы на пары оптических изомеров

       В последние годы изучается влияние  температуры на процесс удерживания  в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложен ее высокотемпературный вариант, характеризующийся высоким разрешением и скоростями анализа. Особую роль призваны сыграть термо- и гидролитически стойкие полимерные сорбенты, поскольку колонки на силикагельной основе имеют ограниченное время жизни при высоких температурах. Многообещающей представляется оптимизация разделений при одновременном программированном изменении температуры и элю-ирующей силы элюента.

       Уникальная  информация получена при исследовании хроматографическим методом химической природы и свойств поверхности твердых тел: адсорбентов, катализаторов, полимеров, композиционных материалов, при изучении изменения структуры и свойств поверхности материалов в результате их термообработки, химического или адсорбционного модифицирования. Методом "обращенной" газовой хроматографии изучены фазовые переходы, имеющие место во многих полимерных материалах при повышении температуры и влияющие на кинетику диффузии тест-молекул в фазе этих полимеров. "Обращенная" жидкостная хроматография дала наиболее надежные сведения о структуре пористых полимеров разной природы, силикагелей, оксидов титана и циркония, целлюлозы, каолинитов, катализаторов и т.д., - диаметр пор и распределение их по размерам. Хроматография позволяет изучать механизмы межмолекулярных взаимодействий непосредственно на поверхности тел, механизмы адсорбции на поверхности, кинетику диффузии в жидких, жидко-кристаллических, твердых и пористых телах.

       СОРБЕНТЫ  ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ РАЗДЕЛЕНИЙ

       С 1952 г. - времени открытия А. Мартином и А.Т. Джеймсом газо-жидкостной хроматографии - описано более тысячи видов стационарных жидких фаз. В аналитической практике используются в основном 10-15 типов жидких неподвижных фаз. Особенно популярны полиметилсилоксаны типа SE-30 и OV-1, которые стабильны до температуры 300-350°С в режиме программирования температуры колонки. Это - неполярные фазы, и объемы удерживания сорбатов на них практически пропорциональны их температурам кипения. Для увеличения полярности в полиметилсилоксановые фазы вводят полярные цианопропильные группы, богатые p-электронами, фенильные и др. Универсальной признана фаза полибисцианопропилфенил (14%) диметил (86%) силоксан, имеющая три типа групп. Вместо сквалана (максимально допустимая температура применения 100°С) предложена более термостабильная фаза - полиоктил (50%) метил (50%) силоксан. Большой интерес для разделения изомеров, в первую очередь оптических, представляют полисилоксановые фазы с химически связанными a, b, и g-циклодекстринами и их О-производными.

       Выпускается широкий ассортимент твердых сорбентов для адсорбционной газовой хроматографии. Для разделения и анализа газов (Не, Ne, Hz, Ar, Kr, Xe, HD, D₂, HT, DT, O₂, N₂ CH₄, C₂H₄, CD₂, C₂D₆, CO, NO) имеются однороднопористые цеолиты (молекулярные сита) и карбосита, для универсального применения разработаны макропористые адсорбенты - силохромы, порасилы, пористые стекла, карбопаки, пористые полимеры (тенакс, хромосорб 101 и 103) и др.

       И все же в газовой хроматографии  наиболее распространен капиллярный  метод. За рубежом более 70% анализов выполняется этим методом. Высокая разделительная способность колонок достигается за счет их большой эффективности, обусловленной минимизацией диффузионных путей сорбата как в газовой фазе, так и в предельно тонком слое сорбента. Потребителям доступны колонки с эффективностью несколько сот тысяч теоретических тарелок. На подобных капиллярных колонках разделяется до 400-500 компонентов, например бензиновых фракций нефти. Капиллярная хроматография реализуется в двух вариантах: газо-жидкостном и газо-адсорбционном. В первом варианте пленку жидкой неподвижной фазы толщиной от 0.1 мкм до нескольких микрометров наносят или химически закрепляют на внутренней поверхности полой капиллярной колонки. В газо-адсорбционном варианте на стенке капилляра создают тонкий (порядка 20 мкм) пористый слой адсорбента - полимера, силикагеля, оксида алюминия, углерода или цеолита. Такие капиллярные адсорбционные колонки высокоселективны.

       Сорбенты  для высокоэффективной жидкостной хроматографии чаще всего представляют собой сферические микрочастицы (диаметр 3-5 мкм) макропористых оксидов  кремния, реже алюминия. Если требуется  повышенная гидролитическая стабильность материала колонок, используют пористые оксиды циркония или титана. Из органических материалов применяют пористый углерод и сополимеры стирола с дивинилбензолом. При разделении низкомолекулярных соединений оптимальным считается диаметр пор жесткой матрицы сорбента 100-150 А; крупные поры около 300 А необходимы для разделения белков, нуклеиновых кислот и синтетических макромолекул. Поверхность сорбентов на основе силикагелей обычно подвергают модифицированию химической прививкой алкильных цепей, которые могут содержать и полярные функциональные группы. Для повышения химической стабильности материала и предотвращения размывания хроматографических зон за счет неконтролируемых взаимодействий с остаточными силанольными группами последние блокируются обработкой триметилхлорсиланом.

       Более частое применение в высокоэффективной жидкостной хроматографии находят сорбенты с привитыми алкильными группами C8 и С18. Фирмы выпускают сотни марок подобных сорбентов, которые существенно различаются содержанием органической фазы, величинами фактора удерживания, эффективности, гидрофобности, стерической селективности, ионообменной емкости при разных значениях рН элюента, а также способностью образовывать водородные связи с сорбатом. Чтобы увеличить гидрофобность сорбентов их поверхность модифицируют перфторированными алкильными цепями; чтобы повысить селективность разделения полярных соединений, используют алкильные цепи с полярными группами в середине цепи. Кроме этих универсальных типов сорбентов, выпускаются многие десятки колонок для специальных применений: хиральные, аффинные, для разделения сахаров, аминокислот, органических кислот, лекарств, катехоламинов, прямого анализа физиологических жидкостей и т.д. Довольно модными становятся сорбенты с молекулярными "отпечатками" соединений, подлежащие селективной сорбции, но эффективность таких колонок крайне мала.