Разделение смесей методами хроматографии

       В последние годы в высокоэффективной  жидкостной хроматографии все чаще применяются полимерные сорбенты на основе полистирола-дивинилбензола, оксиэтилметакрилата  и др. Многообещающие результаты получены с сорбентами на основе сверхсшитого полистирола, отличающегося инертностью и совместимостью с любыми жидкими фазами. Разрабатываются материалы для перфузионной хроматографии, в которых сорбционно-активные поры среднего диаметра сочетаются со сквозными макропорами, улучшающими массообмен при высоких скоростях потока. Особо следует подчеркнуть перспективность создания монолитных сорбционных колонок. Специальными приемами полимеризации или поликонденсации формируется единый пористый блок полимерного или силикагельного материала. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

       ОСНОВНЫЕ  ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИИ

       Диапазон  применения хроматографических методов  огромен: от анализа атмосферы планет Солнечной системы до полного  анализа содержимого одной живой  клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контроле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов производства. На каждом из 150 крупных заводов в России в технологическом контроле постоянно функционируют от 100 до 600 газовых хроматографов. Тысячи газовых, жидкостных и ионных хроматографов эксплуатируются в лабораториях Госсанэпиднадзора, экологических центрах, токсикологических лабораториях, в учреждениях Водоканала, в лабораториях Госкомгидромета, в ветеринарных лабораториях, на станциях защиты растений, в лабораториях судебной и судебно-медицинской экспертизы (табл.).

       В биотехнологии хроматография является основным процессом выделения вирусов  гриппа, энцефалита, бешенства и  ящура, очистки вакцин, промышленного  производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллеренов, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмидов, ДНК, антибиотиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ.

       Велико  значение хроматографических методов  в геологоразведке, в частности, в поиске газоносных и нефтеносных  регионов как на суше, так и в  морях, месторождений полезных ископаемых. Все чаще используется хроматография  в энергетике для анализов воды на ТЭЦ и АЭС, для определения теплотворной способности природного газа. И наконец, хроматография находит применение в археологии и в искусстве при изучении старых красок, лаков, покрытий, бальзамов. Относительно новое приложение хроматографии в археологии и геологии - датирование органических останков и донных отложений путем энантиомерного анализа аминокислот. Этот метод позволяет заглянуть в прошлое на 1 млн лет, то есть глубже, чем радиоуглеродный метод, так как многие аминокислоты рацемизуются значительно медленнее, чем распадается углерод 14С.

       Хроматографические  методы незаменимы в контроле качества пищевых продуктов. Пищевую ценность продуктов определяют, анализируя аминокислотный состав белков, изомерный состав жирных кислот и глицеридов в жирах, углеводы, органические кислоты и витамины. В последние годы многие из этих анализов выполняются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для оценки безопасности продуктов в них выявляют пищевые добавки (консерванты, антиоксиданты, подслащивающие вещества, красители и др.), определяют свежесть продуктов, устанавливают ранние стадии порчи и допустимые сроки хранения.

       В пищевых продуктах методами хроматографии  можно обнаружить такие загрязняющие вещества, как пестициды, нитрозамины, микотоксины (афлатоксины, охратоксин А, зеараленон и др.), полиядерные ароматические соединения, биогенные амины, нитраты и др. Загрязнение пищевых продуктов возможно и вследствие проникновения вредных веществ из материалов упаковки, в частности, хлористого винила, бензола, пластификаторов и др. В мясных продуктах определяют анаболитические стероиды, гормоны и другие типы фармацевтических препаратов, злоупотребление которыми характерно для интенсивного животноводства. Отдельная область применения газовой хроматографии - анализ состава аромата пищевых продуктов. Обнаружены тысячи летучих компонентов, из которых лишь несколько десятков определяют характер запаха, остальные придают запаху и вкусу продукта индивидуальность.

       В последние годы возникло новое направление - энантиоселективный анализ компонентов пищи. По соотношению оптических изомеров аминокислот, оксикислот и некоторых иных соединений можно однозначно установить, является ли данный продукт натуральным или содержит синтетические имитаторы и добавки. Энантиомерный анализ показал, что микроволновая обработка пищевых продуктов, в отличие от жесткой термической, не приводит к рацемизации аминокислот. Однако все молочные продукты, подвергнутые процессам брожения, содержат немало (нетоксичных) D-аланина и D-аспарагиновой кислоты - продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий.

       В природных жирах преобладают  цис-изомеры жирных кислот. Недавно  обнаружено, что транс-изомеры повышают содержание липопротеинов низкой плотности  и уменьшают концентрацию липопротеинов  высокой плотности в крови, что  может способствовать развитию атеросклероза. Разработка методики газохроматографического разделения и анализа всех изомеров жирных кислот заставила производителей в несколько раз снизить содержание транс-изомеров ненасыщенных кислот в маргарине.

       Методом газовой хроматографии в некоторых  сырах выявлено много нежелательных физиологически активных биогенных аминов, и эти сорта сыра были запрещены. В Японии в пищевых продуктах используется L-триптофан, полученный с помощью генной инженерии и биотехнологии. И когда у тысяч людей обнаружили неизвестное ранее заболевание и десятки заболевших умерли, хроматографическими методами было установлено, что эти трагические последствия вызваны наличием токсичных загрязнений в триптофане (выявлено 60 примесей). Газохроматографическому анализу подвергаются вина, коньяки и другая спиртосодержащая продукция. В 1997 г. в России вышел ГОСТ по определению методом газовой хроматографии микропримесей в водке и пищевом этиловом спирте.

       Хроматография активно используется для диагностики  заболеваний. Хроматографический контроль биохимических маркеров и метаболитов применяется для скрининга населения и выявления опасных заболеваний, подтверждения специфических заболеваний, мониторинга эффективности терапии или появления противопоказаний, предсказания прогноза лечения, определения рецидивов заболевания. В одних случаях для надежной диагностики заболевания достаточно оценить уровень нескольких биохимических маркеров, в других - определяется метаболический профиль многих компонентов.

       Биологическими  маркерами являются сравнительно небольшие молекулы: катехоламины, аминокислоты (например, гомоцистеин), индолы, нуклеозиды, порфирины, сахара, стероиды, гормоны, витамины, птерины и липиды. В роли маркеров могут выступать и большие молекулы: отдельные ферменты, белки и нуклеиновые кислоты. Профиль физиологических жидкостей у пациентов с различными заболеваниями значительно отличается от профиля здоровых людей. Профильные анализы проводятся у больных с наследственными метаболическими нарушениями, при онкологических, сердечно-сосудистых, психических и неврологических заболеваниях, а также при диабете и порфириазе. Недавно было установлено, что у больных СПИДом в профиле появляются измененные нуклеозиды. В медицинских центрах различных стран по результатам анализа биохимических маркеров диагностируется более 200 метаболических болезней.

       Недостаточная летучесть и нестабильность при  повышенной температуре многих биологически активных соединений исключают использование  газовой хроматографии при анализе  биологических жидкостей, и тогда  на помощь приходит высокоэффективная жидкостная хроматография. Концентрация многих маркеров в биологических жидкостях крайне низкая (10^-9-10^-12 г/л), поэтому нужны высокочувствительные и селективные детекторы, например амперометрический и флуоресцентный. Во многих случаях хирурги должны получать данные хроматографического анализа в крайне сжатые сроки - от 5 до 20 минут.

       Анализ  биологических жидкостей необходим  также для исследования кинетики и селективности распределения  лекарственных препаратов между  различными тканями и органами, установления терапевтического уровня лекарств и скорости их выведения из организма, изучения процессов метаболизма. Вообще фармацевтические фирмы стали главным потребителем современной хроматографической аппаратуры. Поиск и создание новых лекарств, особенно с привлечением методов комбинаторной химии, теперь уже просто немыслимы без хроматографии.

       Аналитический контроль важен при расследовании  таких частых преступлений, как употребление наркотиков и спиртных напитков, неумышленные и умышленные отравления, злоупотребления лекарствами, а также при убийствах, пожарах, кражах, взрывах, авариях. По статистике, объектами хроматографического анализа чаще всего становятся наркотики (морфин и его производные, кокаин, каннабиноиды, ЛСД и др.), амфетамины, барбитураты, бензодиазепины, различные лекарства и яды, этанол, метанол, ацетон, изопроанол, толуол, хлороформ, дихлорэтан, этилацетат и другие растворители. Составлены обширные базы данных газохроматографических индексов удерживания и масс-спектров токсикологически значимых веществ, лекарств, ядов, пестицидов, загрязнителей и их метаболитов.

       В судебной экспертизе методом хроматографии  анализируют нефтепродукты и  горюче-смазочные материалы, использованные в случае поджогов, выявляют факты  подделок и фальсификаций горюче-смазочных материалов. Анализируют также лакокрасочные материалы и покрытия, в том числе частицы окраски автомобилей, красящие компоненты чернил для идентификации письменных материалов или определения давности документов, древесину, взрывчатые вещества, продукты взрывов и выстрела. Сотни работ опубликованы по хроматографическим анализам биологических объектов для судебной экспертизы, в частности, крови, сыворотки, мочи, слюны, пота, выдыхаемого воздуха, волос человека, образцов ткани и др.

       Столь широкое использование методов хрома-тографии в контроле пищевых продуктов, промышленных процессов, мониторинге загрязнений окружающей среды, в медицине и других жизненно важных областях были бы невозможны без массового выпуска современных хроматографов. Хроматографическое приборостроение сконцентрировало в себе последние достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных. Высокий спрос на хроматографическую аппаратуру позволил фирмам-производителям вкладывать большие средства в непрерывное совершенствование хроматографов. Современная хроматография - это и мощная отрасль промышленного производства. Сотни фирм во всем мире выпускают хроматографическую аппаратуру и вспомогательное оборудование на сумму более 5 млрд. долл. ежегодно.

       В последние десятилетия наметилась тенденция к миниатюризации хроматографической аппаратуры. Портативные хроматографы, сохраняющие аналитические характеристики стационарных приборов, незаменимы в полевых условиях, однако они становятся все более популярными и в лабораториях, так как потребляют меньше электроэнергии, газов-носителей или растворителей, занимают меньше места. Создаются капиллярные и наноколонки для жидкостной хроматографии, которые напрямую сочетаются с масс-спектрометрометрическим детектором. Следующий актуальный для XXI столетия уровень миниатюризации - это приборы на основе кремниевой технологии - на чипах.

Основные  понятия и классификация  методов жидкостной хроматографии.

Жидкостную  хроматографию подразделяют на несколько  классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое  аппаратурное оформление бумажной и  тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов  в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму  взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают  адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную  и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография. Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография. При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).