Виробництво ферменту глюкозооксидази

ДР 2.3. Компресування повітря

Після цього  повітря стискають у турбокомпресорі (Ко 3) до 0,35 – 0,5 МПа. Тиск повітря за компресором визначають із розрахунку тиску на подолання опору в системі підготовки повітря, тиску стовпа рідини в ферментаторі і створення в ньому тиску 0,13 – 0,14 МПа. Стиснення повітря в компресорі призводить до підвищення його температури до 120 – 250℃ і збільшення вмісту вологи на одиницю об’єму.

ДР 2.4. Охолодження повітря

У разі високого вмісту вологи у вихідному атмосферному повітрі під час його охолодження  конденсується ще більше вологи. Осідання вологи на фільтрах неприпустиме, оскільки це призводить до злипання волокон і утворення каналів, що значно погіршує осадження частинок. Крім того, на зволожених волокнах фільтрів можливе розмноження осілих мікроорганізмів, що супроводжується додатковим забрудненням повітря. Щоб забезпечити випадання вологи в крапле вловлювачі, повітря «переохолоджують» до температури 25 – 40 ℃ в теплообмінному апараті (Т 4). Надалі, для забезпечення надійної роботи фільтрів другого і третього рівнів, повітря нагрівають до температури 70 – 90 ℃. При таких температурах не відбувається конденсація пари води на волокнах фільтра.

ДР 2.5. Регуляція термодинамічних показників

На даному етапі  повітря після теплообмінника потрапляє  у ресивер (Рв 5), де відбувається регуляція  його термодинамічних показників, тобто врівноважується швидкість потоку повітря, його температура тощо. Це необхідно для того, щоб при подальшому потраплянні повітря на фільтри, воно їх не пошкожувало.

ДР 2.6. Очистка повітря в головному фільтрі

    Попереднє  очищення повітря від мікрофлори здійснюють в головному фільтрі (Ф 6). Головний фільтр представляє собою циліндричний сосуд із специфічним днищем та кришкою, що знімається. Всередині  фільтра розташовані дві решітки, між якими поміщають фільтруючий матеріал. Для набивки головних фільтрів використовують нитки і волокна скляного однонаправленого по ГОСТ 10727-73 чи холсти з мікро-,ультра-,супер-тонких, скломікрокристалічних штапельних волокон з горних порід по ГОСТ УССР 1970-86 або вироби теплоізоляційні з скляного штапельного волокна по ГОСТ 10499-78. Висота шару фільтруючого матеріала 1,2м. Щільність упаковки від 300 до 400 кг/м³. Здрібнювання, стікання, забруднення та зволоження фільтручого матеріалу свідчить про його непридатність. Заміну фільтруючого матеріалу виконують не рідше 1 раз в рік. При заміні фільтруючого матеріалу виконують подачу повітря через головний фільтр, надлишковий тиск в ньому знижають до нуля, знімають кришку і решітку та дістають відпрацьований фільтруючий матеріал. Очищають від залишків фільтруючого матеріалу та іржі і заповнюють новим фільтруючим матеріалом, рівномірно його ущільнюючи.

Волокна укладають  перехресним способом, не допускаючи при цьому їхнього перегину. По закінченню набивки  фільтра закріплюють  решітку, встановлюють кришку і проводять  перевірку на герметичність при тиску 0,07-0,08 МПа протягом 30 хв. Тиск контролюють по манометру. Фільтр вважають герметичним якщо протягом 30 хв тиск зменшується не більш ніж на 0,005 МПа. Після зняття, тиску приступають до стерилізації фільтра гострою парою при тиску 0,15-0,18 МПа протягом 2 год., потім продувають повітрям від 6 до 8 год. до повного видалення вологи.

Стиснуте стерильне  повітря використовують для остаточної очистки від мікроорганізмів  в індивідуальних фільтрах.

ДР 2.7. Очистка повітря в індивідуальних фільтрах

      Остаточне очищення повітря від  мікроорганізмів виконують в  індивідуальних фільтрах (Ф 19, Ф 20, Ф 21)  для реакторів з використанням в якості фільтруючого матеріалу елемента ²Втулка² згідно ТУ 88УССР 147.036.85. Індивідуальні фільтри для посівних апаратів представляють собою циліндричний сосуд із з¢ємною кришкою і рубашкою. В корпусі фільтра встановлюється чотири пористих проникних елемента з титанових порошків.

Стан фільтруючого матеріалу  контролюють перед  кожною загрузкою Заміну пористих елементів здійснюють при забрудненні поверхні елемента. Регенерація елементів здійснюється у відповідності з інструкцією.  

ДР 3. Приготування та стерилізація поживного середовища

Даний етап технологічного процесу включає в себе приготування необхідних компонентів поживного середовища та їх стерилізація. Для виробництва ферменту глюкозооксидази ми готуємо поживне середовище у чотирьох змішувачах (Зм 7, Зм 8, Зм 9, Зм 10). Готують середовище культуральної рідини,що має склад однаковий для інокулятора, посівного апарата та виробничого ферментера.

Середовище  готують при ретельному перемішуванні до відсутності грудочок (злипання компонентів суміші), що може негативно відобразитися на засвоюваності даного поживного середовища мікроорганізмом. Після перемішування до однорідної консистенції його перекачують насосом (Н 11). В окремих змішувачах ми готуємо компоненти поживного середовища: розчин сахарози, розчин солей, розчин фосфоровмісних солей та солодовий екстракт.

           Стерилізують поживне середовище в установці УБС – 20, що складається з колонки швидкісного нагріву (К 12), де його миттєво нагрівають до  125ºС; витримувача (То 13),  де підтримують дану температуру протягом 30 хв; теплообмінника-рекуператора (То 14) та теплообмінника-охолоджувача (То 15) , де поживне середовище охолоджується до температури, оптимальної для росту мікроорганізму. Потім це середовище перевіряють на стерильність висівом 0.1 мл його на МПА з наступною витримкою в термостаті при 37ºС протягом 1 доби.

ТП  4. Отримання партій посівного матеріалу

ТП 4.2., 4.3. Вирощування культури в пробірках  та колбах

  Спочатку культуру гриба вирощують в пробірках з середовищем Чапека: Сахароза - 30 г

КNO₃ - 3 г

KH₂PO₄ - 1 г

MgSO₄ * 7H₂О – 0,5 г

KCl –  0,5 г

Сусло-агар 15 г

до 1 л  дистильованої води, pH середовища 5,2.

А приблизно через добу, коли культура перебуває у фазі активного росту, здійснюють серію послідовних пересівань на свіжі середовища живлення, поступово збільшуючи кількість інокульованих пpoбipoк з культурою вдвічі. Отримавши необхідну кількість пpoбipoк, культуру гриба з поверхні агаризованого середовища збирають методом змиву та пересівають на поживне середовище в колби  ємкістю 500 см³ по 250 мл.

Інокульовані  колби поміщають у термостат, що має температуру (25±2)°С. Через одну добу з'являються колонії гриба Penіcillium funiculosum .

Визначають  активність росту культури. Після досягнення фази активного росту інокулят в колбах передають на наступну стадію технологічного процесу.  

ТП 4.4. Культивування культури в інокуляторах

Інокуляцію стерильного середовища культурою Penіcillium funiculosum здійснюють у відношенні 0,1:1 посівного матеріалу до живильного середовища. В інокуляторах (Р 16) постійно підтримується стабільний температурний режим в межах (25+2)°С та здійснюється постійна подача стерильного повітря із розрахунку 0,40—0,35 дм³ повітря на 1 дм³ поживного середовища за 1 хв.  Вирощування культури гриба в aпapaтi здійснюється при постійному пepeмiшyванні культуральної рідини мішалкою. При максимальній кількості активної біомаси культуру передають насосом на наступну стадію. Тривалість цього етапу становить близько однієї доби.

ТП 4.5. Культивування культури в  посівних апаратах

Склад поживного  середовища в посівному aпapaтi (Р 17) відповідає складу середовища в інокуляторі. Коефіцієнт заповнення апарату поживним середовищем — 0,5. Вирощування культури Penіcillium funiculosum в посівному aпapaтi проводять за тими ж технологічними параметрами, як i в попередньому aпapaтi і перекачують насосом до промислового ферментера.

ТП  5. Виробничий біосинтез

ТП 5.1. Культивування культури у промисловому ферментері

 Засів ферментера (Р 18) виконується посівним матеріалом, що вирощений в апараті  посівному. Засів виконують по посівній лінії, котру перед цим ретельно перевіряють, усувають виявленні дефекти і стерилізують гострою парою протягом однієї години при тиску 0,18-0,20 МПа і температурі 131,5¸1,5⁰С, безпосередньо перед подачею посівного матеріалу у ферментер.

Вирощування Penicillium funiculosum в ферментерах проводять таким самим чином як i в інокуляторах, та в посівних апаратах. При підтримуванні постійної температури близько 25^°С, постійному перемішуванні, подачі повітря та тиску в 0,1 атм., вже через 48 годин продуцент виробляє велику кількість глюкозооксидази, що виділяється в культуральну рідину, в клітині ж тридобової культури залишається його зовсім мала концентрація, близько 15%. По закінченню терміну культивування вміст ферментера перекачують насосом (Н 24) до збірника.

ТП 6. Виділення та очистка ферментного  препарату

ТП 6.1 Центрифугування

Першим етапом на шляху до очищення цільового продукту є розділення культуральної рідини та біомаси. Відділяють культуральну рідину та біомасу центрифугування. Для  цього весь вміст промислового ферментера перекачують до центрифуги (Ц– 2). Після закінчення процесу отримують дві фази – рідку та тверду. Тверда фаза – це міцелій та рештки поживного середовища, а рідка фаза – культуральна рідина, в якій присутні водорозчинні продукти життєдіяльності продуцента, в тому числі глюкозооксидаза.

ТП 6.2 Адсорбція глюкозооксидази

Адсорбція проводиться  в адсорбері (АД–4), в якому знаходиться  безводний оксид алюмінію. Адсорбер наповнюється культуральною рідиною  так, щоб між рідиною та кришкою  залишалась мінімальна кількість повітря. Цим досягається найменша аерація, що веде до інактивації ферменту.

ТП 6.3 Елюція глюкозооксидази

Елюція ферменту здійснюється в адсорбері, в який в три етапи подають елюент – хлористий амонній. Елюцію повторюють три рази з періодичністю в 120-130 струшувань за хвилину. На першому етапі сорбент обробляють 9%-м розчином хлористого амоннію, забуференого 0,3М розчином КН2РО4, другу та третю елюцію проводять тими же розчинами, але при половинних концентраціях елюента. Елюент витрачається із розрахунку 0,40 – 0,45 л на 1 кг оксиду алюмінію. Тривалість елюції 1,0 – 1,5 год.

ТП 7. Концентрування ферментного препарату

ТП 7.1 Осадженння ферменту етиловим спиртом

Для виділення  ферменту використовують осадження  етиловим спиртом. Процес проводиться  на холоді при температурі елюата 0 С та етилового спирту – 10 С. Осаджувач додають при перемішуванні в співвідношенні 2:1.

ТП 7.2 Центрифугування

Суміш центрифугують  в охолоджених гільзах 8 – 10 хв при 3000 – 4000 об/хв.

ТП 7.3 Розчинення осаду

 Осад глюкозооксидази  при осадженні етиловим спиртом містить значну кількість хлористого амонію та фосфорнокислого двозаміщеного калію. З метою звільнення від солей осад 2-3 рази обробляють льодяною дистильованою водою, при цьому глюкозооксидаза легко розчиняється, а солі залишаються в осаді, які відділяють подальшим центрифугуванням.

ТП 7.4 Осадження ферменту ацетоном

Із об’єднаного  центрифугату, охолодженого до 0 С, глюкозооксидазу  осаджують додаванням до неї подвійного об’єму ацетону, охолодженого до – 10 С

ТП7.5 Центрифугування

Нерозчинний осад солей відділяють п’ятихвилинним центрифугуванням в охолоджених гільзах при 5000-6000 об/хв.

ТП 7.6 Розчинення осаду

Потім фермент  вилучають із осаду, як і після  осадження спиртом, декількома порціями льодяної дистильованої води.

ТП 8. Отримання готового продукту

ТП 8.1 Сушіння ферменту

Сушіння ферменту відбувається в розпилювальній сушарці (РС – 18). Осад перед висушуванням розчиняють у воді до вмісту сухих речовин 20 – 25 %. Тривалість сушіння – 5-8 с. Препарат не нагрівається більше 35 – 40 ^оС. Втрати активності порівняно малі (7 – 10 %).

ТП 8.2 Стандартизація ферменту

На цьому  етапі проводять перевірку властивостей ферменту і в залежності від його активності стандартизують кінцевий продукт. Якщо активність ферменту менша за 330000 од., то його в змішувачі перемішують з глюкозооксидазою більшої активності до отримання суміші з активністю, що відповідала б встановленому значенню. Якщо ж активність значно перевищує необхідну, то ферментний порошок  розбавляють баластним білком (лактатом натрію) до потрібного значення активності.

ПМВ 9. Пакування, маркування та відвантаження готової продукції

ПМВ 9.1 Фасування

Висушену глюкозооксидазу  фасують у спеціальні пакети на фасувальній  машині ДУ – 19.

Фасувально-пакувальному обладнанню надають індекси, в яких букви  означають назву обладнання, його призначення, а цифри — найбільшу масу однієї порції або продуктивність машини. Дозатор працює за принципом подвійного зважування: продукт, що надходить у дозатор з накопичувального бункера, крізь воронку направляється в об'ємну камеру, де відбирається доза з недовантаженням і доводиться до заданого значення маси на рівноплечому коромислі. Сформована доза крізь випускну воронку потрапляє в пакет з плівкового полімерного матеріалу, розміщений на робочому столі.

ПМВ 9.2 Маркування

Загальні вимоги до маркування відповідають вимогам ДСТУ 4260. Кожну одиницю спожитої тари маркують маркувальною установкою (ММ - 20) наклеюванням етикетки чи безпосередньо на пакуванні друкарським чи іншим способом.

Маркування  містить таку інформацію, викладену державною мовою:

• назву харчового продукту, його вид;
• концентрацію діючої речовини у відсотках;
• назву та повну адресу і телефон виробника;
• склад харчового продукту;
• кінцеву дату споживання;
• умови зберігання;
• спосіб застосування;
• позначення цього стандарту.