Виробництво ферменту глюкозооксидази

Вступ

Стан біотехнологічної галузі потребує великої уваги з  боку держави, тому що роль сучасної біотехнології  є вирішальною для становлення  економіки України, розвиток котрої базується на впровадженні високотехнологічних  виробництв. Залучення біотехнологічних розробок уможливлює розв’язання актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості [6].

Якщо розглянути фармацевтичний ринок України, то його структура  відрізняється від світового. В  Україні найбільший сегмент ринку займають пробіотики, вакцини і сироватки, а далі – білки крові, антибіотики, ферменти і потім генно-інженерні препарати. У медицині біотехнологічні прийоми і методи відіграють головну роль при створенні нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів, призначених для здійснення ранньої діагностики та лікування різноманітних захворювань. Велика увага  приділяється виробництву ферментів [16].

 Ферменти – речовини  білкової природи, здатні каталізувати  різноманітні реакції перетворення речовини та енергії. Вони відіграють винятково важливу роль у процесах життєдіяльності організмів, здійснюючи обмін речовин, процеси їх асиміляції та дисиміляції. Але не тільки в організмі, а й виділені у чистому вигляді ферменти у певних умовах каталізують різноманітні перетворення, які мають велике значення у різних галузях практичної діяльності [17].

До сьогодні описано понад 3000 ферментів, проте лише кілька з них одержують  у промисловості. У мікроорганізмів  виявлено понад 1500 різних ферментів, причому в кожній клітині міститься в середньому 100 тис.  молекул ферментів. За останні 40 років майже всі нові ферментні препарати одержано за допомогою мікроорганізмів.

 

 

 

 Така «монополія»  ферментів мікробного походження  зумовлена високою швидкістю росту мікроорганізмів-продуцентів на доступних і відносно дешевих поживних середовищах, а також можливість модифікації ферментів  методами генетичної інженерії. Ферменти і ферментні системи можуть функціонувати in vitro, проте їх джерелом є живі організми, з певною генетичною програмою, тому фізіолого-біохімічні властивості продуцента визначають і характеристику біокаталізатора [16].

За даними 1990 р. [16] на світовому ринку комерційний оборот від реалізації технічних ферментних препаратів становив 800 млн доларів. 80 % усіх ферментів технічного призначення використовувались у таких трьох галузях, як гідроліз крохмалю – 40 %, виробництво детергентів – 30, виробництво сирів – 10 %. На сьогодні товарообіг промислово одержуваних ферментів становить понад 1 млрд доларів на рік. Як показує аналіз реалізації ферментів за останні 10 років, виробництво ферментів мікробного походження має тенденцію до зростання – в середньому 5-7 % на рік (деякі експерти називають цифри 10-15 % [16].

Актуальність  теми. Серед ферментів, які продукуються міцеліальними грибами, важливе місце займає глюкозооксидаза (𝛽-D-глюкоза, О₂ – оксидоредуктаза) (ГО), що каталізує окиснення 𝛽-D-глюкози до глюконової кислоти. Цей фермент використовується в багатьох галузях харчової промисловості, таких як: консервна, виноробна, м’ясна для вилучення кисню, що сприяє підвищенню стійкості продуктів тривалого зберігання і збереженню кольору. З застосуванням окремих прийомів за допомогою глюкозооксидази можна зберігати сир, свіжі м'ясо і рибу, борошно, крупи. Ефективним є використання глюкозооокидази для промислового одержання глюконової кислоти. Глюконова кислота (Е 574) використовується у світовій харчовій промисловості як регулятор кислотності і розпушувач, засіб, що інгібує мікроорганізми, як зв'язувальна речовина для іонів металів [3].

В останні роки широко застосовується ГО як аналітичний  реагент у клінічній діагностиці  і біосенсорних технологіях для  визначення глюкози у біологічних  рідинах, їжі і технологічних  процесах [1].

Перспективним напрямком використання ГО є розробка технології фруктово-овочевих нектарів лікувально-профілактичного призначення для людей з порушеним вуглеводним обміном – цукровий діабет другого типу. В основі лікування такого типу діабету покладена дієтотерапія, заснована на зниженні у раціоні харчування легкозасвоюваних вуглеводів. Найбільш прийнятним вуглеводом є фруктоза, що метаболізується у організмі людини без участі інсуліну. Розробка технології виробництва ферментного препарату глюкозооксидази та її використання при виробництві фруктово-овочевих нектарів з низьким вмістом сахарози і глюкози є актуальним [3].

Новизною є вибір штаму гриба Penicillium funiculosum KM МГУ 433 – продуцента  позаклітинної глюкозооксидази, що здатен синтезувати глюкозооксидазу за відсутності комплексних органічних сполук невизначеного складу [20].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 2. Технологічна частина

 

2.1. Характеристика  кінцевої продукції – ферменту  глюкозооксидази

Препарати, що містять глюкозооксидазу

Застосування  цих препаратів пов’язане з необхідністю в певних випадках видаляти з продуктів глюкозу або кисень. Обробка продукту перед сушінням глюкозооксидазою дозволяє перевести глюкозу в глюконову кислоту, що виключає утворення підвищеного цвітіння в сухому продукті. Цей фермент частіше використовується у виноробстві, пивоварінні, консервній та безалкогольній промисловості для видалення кисню, що сприяє підвищенню стійкості продуктів до тривалого зберігання. Глюкозооксидаза застосовується разом з каталазою, так як їх каталітична активність взаємопов’язана. Реакція проходить за наступною схемою:

2С₆Н₁₂О₆ + 2О₂ + 2Н₂О            глюкозооксидаза           2С₆Н₁₂О₇ + 2Н₂О₂

 

                            2Н₂О₂              каталаза                    2Н₂О + О₂

             

                 2С₆Н₁₂О₆ + О₂         два ферменти                  2С₆Н₁₂О₇

 

Введення ферменту в напої в момент закупорювання  дозволяє повністю видалити з продукту та повітряного об’єму кисень, що сильно сповільнює окислення різноманітних  сполук та робить можливим розвиток мікроорганізмів. Цей фермент може наноситися у вигляді тоненького покриття на пергамент разом з необхідною кількістю глюкози та буферних солей. Герметична упаковка в такий пергамент, наприклад, вершкового масла запобігає згіркненню масла та його втрати при зберіганні. Волога, що виділяється з масла, розчиняє ферменти, буферні солі, глюкозу та кисень, що

 

 

 

знаходиться в  повітряному просторі між  маслом та пергаментом, розходиться на окислення  глюкози та повністю вживається. В  такій атмосфері масло може зберігатися  без утворення згірклого шару довгий час. Застосовуючи певні прийоми, за допомогою глюкозооксидази  та без кисневого середовища можна зберігати сир, сире м'ясо, рідкі концентрати, борошно, крупи, майонез, молоко і т.д. Очищені препарати глюкозооксидази можуть бути використані як лікувальний засіб для обробки ран та опіків.

Механізм дії та властивості  глюкозооксидази

Субстрат. Субстратом для глюкозооксидази є глюкоза. Цей фермент має високу специфічність по відношенню до субстрату. Він здатний окислювати 𝛽-D-глюкозу, проявляючи особливу подібність до другого та третього атома вуглеводу в молекулі 𝛽-D-глюкози. Під дією глюкозооксидази 𝛽-D-глюкоза перетворюється в глюконову кислоту [8].

Глюкозооксидаза відноситься до флавінових ферментів. Вона каталізує окислення глюкози за рахунок молекулярного кисню. Наявність ферменту, що каталізує пряме окислення глюкози за рахунок молекулярного кисню без виділення вуглекислого газу, була виявлена ще в 1904 р. М.А. Максимовим у відпресованій рідині з гриба Aspergillius niger. Він же відмічав те, що ці розчини підкислюються. Подальші дослідження підтвердили встановлений факт та показали, що поглинання кисню відпресованою рідиною з гриба в присутності глюкози пов’язане з утворенням глюконової кислоти. Д. Мюллер назвав цей фермент глюкозооксидазою. Пізніше було встановлено, що цей фермент – не справжня оксидаза, а дегідрогеназа, і оскільки акцептором водню є молекулярний кисень – глюкозоаерогідрогеназа [8].

Препарати, що отримувалися з грибів роду Penicillium мали активним початком глюкозооксидазу, використовувались в медицині як антибіотики та були відомі під назвою : нототин, пеніцилін Б, мікроцид. Пізніше було встановлено, що це фермент і що антибіотична дія пов’язана або з  у твореним перекисом водню, або з процесом споживання з реакційного середовища кисню.

Механізм дії. Механізм реакції, що каталізується глюкозооксидазою, вивчався багатьма дослідниками. Так як глюкозооксидаза відноситься до флавопротеїнів, які в своїй більшості є дегідрогеназами, було поставлене питання про те, яким же чином здійснюється окислення глюкози. Чи відбувається перенесення двох атомів водню від глюкози або її гідратно-альдегідної форми на молекулярний кисень, що є акцептором водню, або ж шляхом активації молекулярного кисню, в результаті чого один із кисневих атомів з’єднується з альдегідною групою глюкози, а другий взаємодіє з водою і утворює перекис водню. Для з’ясування цього механізму Р. Бентлей та А. Нейберг при вивченні культури P. notatum використовували мічені воду та кисень. Результати цих дослідів дозволили авторам прийти ло висновку, що досліджуваний фермент каталізує перенесення водню від глюкози на кисень. Так як в процесі цього переносу не спостерігається утворення вільного радикалу, вони вважали більш ймовірним перенесення двох електронів. Пізніше С. Нокамура та ін. (1967), використовуючи в своїх дослідах високо очищений фермент глюкозооксидазу P. amagasakiense на основі кінетичних досліджень встановили, що під час реакції флавінаденіндинуклеотидна (ФАД) група глюкозооксидази не перетворюється в скільки-небудь помітних кількостях в семихінон. Вчені, розбираючи загальні питання механізму реакцій, що каталізуються флавопротеїнами , прийшли до висновку, що картина загального механізму відновлення наступна : два водні переносяться у вигляді протонів, а субстрат утворює ковалентний зв'язок із системою кілець флавіну. Утворення та розщеплення цих проміжних сполук передбачає механізм транспорту електронів який відображає суть ферментативної реакції, що протікає. А відповідні місця розташування на поверхні білка кислих та основних груп забезпечують каталіз дегідрування та відповідають за швидкість ферментативних реакцій [8].

Вивчення кінетики глюкозооксидазної реакції дозволяє стверджувати, що в процесі каталізу ФАД-частина ферменту може знаходитися або в повністю окисненій, або в повністю відновленій формі. Таким чином, в найзагальнішому вигляді процес окислення 𝛽-D-глюкози глюкозооксидозаю можна виразити в два етапи. Спочатку   𝛽-D-глюкоза в присутності кисню перетворюється в 𝛿-глюконолактон. Другий етап реакції проходить самовільно без участі ферменту. В присутності води 𝛿-глюконолактон перетворюється в глюконову кислоту. Глюкозооксидаза, подібно іншим флавіновим ферментам не каталізує реакції безпосереднього окиснення субстрату молекулярним киснем. Замість цього відбувається перенесення атомів водню через проміжні зв’язки за участю ФАД, який грає роль простетичної групи у ферменті:

      

   𝛽 – D- глюкоза + ФАД                                 δ – Глюконолактон + ФАДН₂

 

                   ФАДН₂ + О₂                                                         ФАД + Н₂О₂

 

Із схеми  видно, що два атома водню переносяться на флавінову группу ферменту , а  лише потім – на молекулярний кисень. Глюкозооксидаза є складним ферментом, який складається з простетичної групи (дві молекули ФАД) і глюкопротеїду. У формуванні активного центру і просторової структури ферменту приймає активну участь простетична група глюкозооксидази. Багатьма дослідниками  висувається думка про те, що ФАД можна розглядати як місток між субодиницями в молекулі ферменту. Залишається й досі не до кінця зрозумілим те, чи являються молекули ФАД учасниками каталітичного акту та  входять в активний центр ферменту або жодна з них виконує роль стабілізатора структури ферменту [8].

При елекронно-мікроскопічному дослідженні кристалічних гомогенних препаратів глюкозооксидази, негативно контрастованих урамілацетатом, були виявлені крупні пачки трубоподібних утворень, укладених бік о бік, а також окремі труби діаметром близько 220 Å і товщиною стінок 50  Å. Труби можна розглядати як трубчасті кристали, стінки яких представляють монослої молекул. В стінках труб молекули укладені по спіралі з кроком близько 60 Å. На основі картини оптичної дифракції зроблений висновок  про те, що найбільш вірогідними є параметри спіралі, в якій на період повторення припадає 11 витків та 50 молекул. На профільних зображеннях при включенні у фільтрацію ближніх рефлексів молекули виглядають створеними з двох чітко різних половинок, кожна яких в свою чергу складається з двох субодиниць.

Фізично-хімічні  характеристики глюкозооксидази : спектр її поглинання – 𝜆_max  при 278/280, 380, 460 нм і 𝜆_min при 250, 320 і 410 нм. Відношення D₃₈₀ /D₄₆₀ в препаратах кристалічної глюкозооксидази дорівнює одиниці. Молекулярна маса ферменту, визначена методом світлорозсіювання, дорівнює 150 000 та константа седиментації – 7,8•10 ̄ ¹³ с ̄¹. Молекулярний коефіцієнт екстинції кристалічних препаратів глюкозооксидази при 460 нм дорівнює 2,20•10⁴ М ̄ ¹•см ̄ ¹. Ізоелектрична точка, визначена методом електрофокусування в ПААГ, знаходиться в області рН 4,7 – 4,8. Оптимальний рН для дії фермента знаходиться в інтервалі 5,6 – 5,8.

Термостабільність глюкозооксидази порівняно висока. Так, 15-хвилинне прогрівання розчинів кристалічної глюкозооксидази при температурі до 50℃ в діапазоні рН від 4,0 до 5,6 не знижує активності ферменту. Прогрівання ж при цих же умовах, але при температурі 56℃ викликає зниження активності на 10 – 12 %. Повна інактивація глюкозооксидази наступає при 15-хвилинній експозиції при температурі 70 ℃. Глюкозооксидаза наділена високою специфічністю, її молекулярна активність по відношенню до 𝛽-D-глюкози дорівнює 42 000 од./мл.