Виробництво ферменту глюкозооксидази

Іони ртуті  та міді в концентрації відповідно 10 ̄ ³ та 10 ̄ ⁵ знижують активність та термостабільність ферменту. Іони кальцію та амонію в концентрації , що перевищує концентрацію іонів ртуті на 1-2 порядки, захищають фермент від інгібуючої дії цими іонами [8].

Галузі застосування глюкозооксидази

 Застосування глюкозооксидази  для аналітичних цілей. Висока специфічність глюкозооксидази по відношенню до глюкози сприяла використанню цього ферменту в якості специфічного реактиву для визначення глюкози в крові та інших біологічних рідинах. Вперше глюкозооксидозу застосували для специфічного манометричного методу визначення глюкози. Потім Кетсонт описав швидкий і простий калориметричний спосіб визначення глюкози за допомогою глюкозооксидази та пероксидази. Завдяки високій специфічності глюкозооксидази по відношенню до глюкози цей метод дає можливість визначити «істинну» глюкозу в рідинах, які містять інші цукри, які при визначенні іншими методами (хімічними) визначаються як глюкоза. Препарати глюкозооксидази дають можливість визначати інші цукри, які наявні у досліджуваному об’єкті, наприклад галактозу, після попереднього окислення глюкози глюкозооксидозою. Глюкозооксидазний метод застосовується також для визначення мальтози і фруктози в рослинах [3].

Застосування глюкозооксидази  в харчовій промисловості. В наш час глюкозооксидаза знайшла застосування в харчовій промисловості для видалення глюкози із ряду продуктів або видалення кисню із продуктів, в яких його присутність призводить до їх псування, втрати аромату, кольору, смакових якостей.

Глюкозооксидоза виявилась ефективною для видалення  кисню з таких напоїв, як фруктові соки, пиво, яблучне вино, при приготуванні майонезу, при упаковці сухих харчових продуктів та ін. Видалення глюкози за допомогою глюкозооксидази застосовується при висушуванні яєць, які є продуктом зі значним вмістом глюкози. В яєчному білці міститься близько 3% глюкози на суху речовину, а в жовтці – 0,5%. Обробка яєць глюкозооксидазою попереджує небажане фарбування в період тривалого зберігання, яке могло з’явитися як результат реакції між глюкозою та аміногрупами білка. Глюкозооксидаза все ширше знаходить застосування при виготовленні майонезі. Відомо, що майонези, приготовані з високоякісної сировини, піддаються поступовому псуванню і через 3-4 місяці зберігання практично є непридатними до вживання. Додана до майонезу глюкозооксидоза, з розрахунку 50 мг % в період приготування, захищає від псування протягом 6 місяців, в той час як контрольні зразки майонезу без глюкозооксидази зіпсувались та згіркли через 3 місяці [3].

 

2.2. Характеристика біологічного агента

 2.2.1. Морфолого-культуральні ознаки

Міцелій Penіcillium funiculosum добре розвинутий, септований. Колонії на агарі Чапека ростуть повільно, спочатку білого, пізніше, рожевого кольору. Агар забарвлюється в тілесний відтінок. Поверхня дрібно пухнаста, вкрита червонуватими дрібними краплинами, край колоній досить широкий, рівнуватий. Діаметр становить 15-18 мм за 7 діб. Конідєєносці мають вигляд бокових відгалужених гіф, розміри яких становлять приблизно 200-250 мкм довжини та 2-3,5 мкм ширини. Гладенькі, з двохярусними верхівковими кісточками. Вітки більшої частини становлять 2-2,5 мкм. На сусло-агарі конідії спочатку білого кольору, з часом – червоно-бурого, поверхня оксамитова, за формою не досить щільні, з широкими білими краями. При старінні можуть набувати помаранчевого кольору або, навіть, коричневого. Колонії на середовищі Чапека з желатиною (20 %) та глюкозою ростуть обмежено, мають біло-рожеве забарвлення, переважають рожеві відтінки, оксамитові, з досить широкими білими краями, желатина забарвлюється в тілесний колір [5].

2.2.2. Фізіолого – біохімічні ознаки

Penіcillium funiculosum здатний отримувати енергію тільки шляхом дихання і тому потребує кисень, який є термінальним акцептором електронів при аеробному диханні. Отже, таким чином продуцент глюкозооксидази є облігатним аеробом. У зв’язку з цим міцелій гриба розвивається переважно у верхніх шарах субстрату і не проникає в його глибину. Потреба Penіcillium funiculosum у воді надзвичайно висока, але насичення водою пористого субстрату небажане, тому що при цьому повітря витісняється із пор і всередині утворюються анаеробні умови, що може призвести до загибелі продуцента. При меншому насиченні гриб проникає глибше і тримається довше на такому субстраті. За типом живлення Penіcillium funiculosum належить до хемоорганотрофних мікроорганізмів, оскільки джерелом енергії, вуглецю та донором електронів є органічні сполуки. Як і більшість інших грибів, Penіcillium funiculosum віддає перевагу кислому середовищу (4,0-5,0 ), тобто є ацидофілом. Проте у процесі росту змінює кислотність середовища до рН 3,0-3,2 це зумовлено виділенням глюкооксидази. По відношення до температури Penіcillium funiculosum є мезофілом. Температурний максимум для росту гриба коливається в межах 37-38 ⁰C, мінімум – в межах 30-32℃. Оптимальна температура для росту – 35-36℃. Світло не має особливого значення. Розвиток спостерігається як в темноті, так і на розсіяному світлі. Але чергування освітлення і темноти стимулює ріст гриба. Щодо розмноження, для Penіcillium funiculosum характерні такі способи розмноження як вегетативне (фрагментація гіфів, їх брунькування, а також утворення хламідоспор, які можуть проростати) та безстатеве розмноження конідіями. Статевого процесу немає, або він не виявлений [5,14].

2.2.3. Таксономічний статус 

Penіcillium funiculosum належить до вищих грибів, оскільки має септований міцелій.

Рід Penіcillium раніше розглядали як представника класу аскоміцетів, так і класу дейтероміцетів. За даними молекулярно – біологічних і генетичних досліджень, недосконалі гриби (Deuteromуcetes) не є самостійною таксономічною групою. Ними або втрачена статева стадія, або вони є аноморфами інших груп грибів ( ймовірніше класів Ascomycetes та Basidiomуcetes). У звязку з цим дейтероміцети повинні бути розміщені у відповідних класах грибів [5,17].

Згідно з  класифікацією грибів, яка була розроблена у 70-х – на поч. 80-х рр. XX ст. Penіcillium funiculosum займає таке положення у систематиці:

Царство – гриби( Fungi);

Відділ –  базидіальні(Basidiomуcetes);

Клас – дейтероміцети(Deuteromуcetes);

Порядок – гіфальні(Hiphales);

Сімейство – Phialosporoceae;

Рід – Penіcillium

Вид - Penіcillium funiculosum

Згідно сучасної класифікації Penіcillium funiculosum займає таке таксономічне положення : Eukaryota  <  Fungi  <  Dikarya  <  Ascomycota  <  Pezizomycotina  <  Eurotiomycetes  <  Eurotiomycetidae  <  Eurotiales  <  Trichocomaceae  <  mitosporic Trichocomaceae  <   Penіcillium  <  Penіcillium funiculosum [17].

2.2.4. Біотрансформація ростового субстрату в глюкозооксидазу

Синтез ферментів  складається із біосинтезу амінокислот  – складових білків та синтезу білка (транскрипція ДНК, трансляція мРНК).

Більшість мікроорганізмів  здатні синтезувати de novo всі 20 амінокислот, з яких складаються білки. Вуглецеві скелети амінокислот будуться з проміжних продуктів обміну, аміногрупи вводяться прямим амінуванням або транс амінуванням. Переведення неорганічного азоту в органічні сполуки завжди відбувається через аміак. Нітрати, нітрити, молекулярний азот (джерела азоту в поживних середовищах) і тільки після цього включаються до складу органічних сполук [16].

Лише небагато амінокислот утворюються в результаті прямого амінування вільними іонами амонію. У первинній асиміляції аміаку беруть участь L-глутаматдегідрогеназа та L-аланіндегідрогеназа, які здійснюють відновлювальне амінування 2-оксокислот (пірувату та 2-оксоглутарату). АТФ у цьому процесі участі не бере. Утворення глутаміну з глутамату каталізується глутамінсинтетазою і потребує витрат АТФ. За допомогою глутаматсинтази аміногрупа глутаміну може бути перенесена на 2-оксоглутарат з утворенням глутамату.

Решта амінокислот  отримує свою аміногрупу від первинних  амінокислот у результаті транс  амінування. З вільних амінокислот  у цитоплазмі кількісно переважає  глутамінова кислота (більше половини усього «пулу» амінокислот) [16].

Всі необхідні  для синтезу білків 20 амінокислот утворюються з певних метаболічних попередників. Субстратами для синтезу амінокислот є кілька сполук – піруват, оксалоацетат, 2-оксоглутарат, 3-фосфогліцерат, фосфоенолпіруват, еритрозо-4-фосфат і 5-фосфорибозил-1-пірофосфат. Оксалоацетат є відправною точкою для синтезу шести амінокислот, 2-оксалоглутарат – попередником синтезу чотирьох, а піруват – трьох амінокислот.

Аланін та аспартат синтезуються з пірувату та оксалоацетату  транс амінуванням з використанням  глутамату як донора аміногрупи. Аспарагін утворюється в реакції, що каталізується глутамінсинтетазою. Відновлення аспартату дає напівальдегід аспарагінової кислоти – попередник лізину, треоніну та метіоніну. Дезамінування треоніну приводить до утворення 2-оксобутирату, який в результаті послідовної дії ферментів перетворюється на ізолейцин. Під дією чотирьох ферментів піруват перетворюється на валін; проміжний продукт синтезу валіну служить попередником в утворенні лейцину. Серин, гліцин і цистеїн синтезуються з 3-фосфогліцерату, а пролін та аргінін – з глутамату [16].

Синтез ароматичних  амінокислот відбувається наступним  чином: еритрозо-4-фосфат і фосфоенолпіруват конденсується з утворенням С₇-сполуки, яка піддається циклізації. Проміжним продуктом синтезу є хоризмат. У цій точці біосинтетичний шлях розгалужується на два: утворення триптофану через антранілат; утворення тирозину та фенілаланіну через префенат.

 

2.3. Обгрунтування вибору технологічної схеми

Технологічна  схема,  що покладена в основу виробництва глюкозооксидази повинна забезпечувати найкраще поєднання виробничих заходів з точним дотриманням оптимальних умов проведення кожної виробничої стадії.

До кожної стадії виробницва  висувають  відповідні вимоги. Проект даного виробництва містить жорсткі вимоги до чистоти виробничих приміщень, де проходить технологічний процес виробництва глюкозооксидази, до роботи технологічного обладнання, вентиляції повітря, системи підготовки основної сировини і допоміжних матеріалів, виробничої санітарії, а також до самого обслуговуючого персоналу [21].

Санітарна підготовка виробництва. Стадія «Санітарна підготовка виробництва» - це одна із найважливіших стадій виробничого процесу, яка направлена на забезпечення чистоти виробництва. Мета такої підготовки - зведення до мінімуму механічних і мікробіологічних забруднень.

 Підготовка персоналу. Основним джерелом контамінації є персонал. Тому у виробничих приміщеннях під час роботи повинно знаходитися мінімальна кількість працюючих, що передбачено відповідними інструкціями [21].

Підготовка  приміщень. Основним напрямом санітарно-гігієнічної підготовки приміщень є забезпечення відповідної чистоти в приміщенні. Для цього на підприємстві проводиться щоденне та генеральне прибирання.

• щоденне прибирання, проводиться наприкінці зміни (вимикають вентиляцію, стіни двері й інші поверхні протирають губкою, змоченою дезінфікуючим розчином, потім цим розчином миють підлогу. Оброблені приміщення звільняють від персоналу і включають бактерицидні лампи. Не раніше, ніж через 30 хв. вмикають вентиляцію);

• генеральне прибирання проводять 2 рази на тиждень під час виробничого процесу та 1 раз на два тижні безпосередньо після обробки приміщення дезинфікуючими розчинами.

Підготовка  дезинфікуючих розчинів для дезінфекції приміщень. У випадку проведення дезинфекції застосовують декілька типів дезинфікуючих розчинів. Серед розчинів пропонуємо застосовувати:

-   розчин хлораміну (1%, 3%);

- розчин хлораміну  Б (1 – 3%). Розчин є бактерицидним та використовується проти вегетативних форм в концентрації 0,25 – 0,5% і температурі 30^оС, спороцидний – при 50 – 60^оС.

- розчин каустичної  соди (40%), який має властивості  дезінфікуючої речовини та детергента.

Миючі та дезинфікуючі засоби слід контролювати на мікробіологічну чистоту. Їх розчини потрібно зберігати у попередньо очищеній тарі та суворо дотримуватись строків зберігання. Дезрозчини мають відповідати таким вимогам: бактерицидна дія; хімічна стійкість; неушкодження поверхонь обладнання.

Підготовка  обладнання і комунікацій. Все технологічне обладнання у виробничих приміщеннях розміщується з урахуванням вимог, які пред'являються до сучасних виробництв.

До переліку операцій, що складають стадію підготовки обладнання входять миття водопровідною  водою, змиви дистильованою водою, обробка дезинфікуючим розчином, стерилізація парою, перевірка на герметичність виконання яких є невід'ємним для досягнення необхідного та бажаного рівня якості продукції [21].

Підготовка повітря. Основною метою підготовки вентиляційного повітря в даному проекті є забезпечення необхідної чистоти у виробничому приміщенні. Для одержання ферменту  глюкозооксидази необхідно проводити підготовку повітря у дві стадії, а саме: попереднього очищення повітря та тонкого очищення повітря.

Попереднє очищення повітря проводиться через фільтр ФЯВ для вилучення механічних забруднень.

Тонке очищення повітря від пилу і мікроорганізмів здійснюють на фільтрах ФТОВ (фільтри тонкого очищення повітря) типу НЕРА, ефективність роботи яких 98 %.

Забір повітря. Система забору повітря з атмосфери розташовують в місцях з мінімальним забрудненням.

Видалення механічних забруднень. Для видалення основної маси механічних домішок, попередження образивного зносу обладнання необхідною є наявність в технологічній схемі відповідного ступеню очищення. В якості фільтрів можуть бути використані мішечні фільтри, фільтрувальні матеріали з синтетичних тканин (нп. вініпласт, синтетичні волокна та ін..).