Виробництво ферменту глюкозооксидази

Оптимальними  визнані сухі коміркові фільтри  типів ФЯВ, ФЯП, ФЯУ, що характеризуються простотою конструкції та високою активністю  видалення механічних часток широкого діапазону розмірів 150 мкм. Також на ефективність очищення повітря в повітрозбірнику впливає правильність встановлення фільтрів.

Стабілізація  термодинамічних показників.Для стабілізації термодинамічних показників у приміщеннях встановлюється кондиціонер. Стабілізація спрямована на підтримку вологості (не більше 60%), температури та створення комфортних умов в приміщеннях при виробництві продукції. Центральний кондиціонер виконує ряд послідовних операцій: підігрів, охолодження, зволоження, транспортування повітря за допомогою вентилятора [11].

Обгрунтування вибору біологічного агента

Відомі продуценти позаклітинної глюкозооксидази  з грибів роду Penicillium. В авторському свідоцтві N 237 080 (1992 р.) описаний штам Penicillium vitale і спосіб отримання глюкозооксидази шляхом культивування його на живильному середовищі, що містить 0,5 - 0,7% кукурудзяного екстракту, 2 % сахарози і 0,2 % нітрату калію. При цьому отримана активність глюкозооксидази  80-100  од / мл [20].

Зважаючи на велике практичне  значення глюкозооксидази в різних країнах ведуться пошуки продуцентів  глюкозооксидази. Так, італійськими дослідниками в якості перспективного продуцента глюкозооксидази відібраний штам Penicillium variabile P16 та розроблено спосіб отримання глюкозооксидази шляхом культивування його на підібраною авторами середовищі з 8% глюкози, 0,3% пептона, 0,5% нітрату натрію, фосфатами та крейдою. Отримано глюкозооксидази 15 од / мл.

В якості прототипу слід прийняти штам Penicillium funiculosum Г-15 і спосіб отримання глюкозооксидази шляхом культивування його на середовищі, що містить (у %): сахарозу - 6,0, KNO₃ - 0,8, К₂НРО₄ - 0,1, MgSO₄ - 0,05 , KCl - 0,05, FeSO4 • 7H₂O - 0,00005, MnSO₄ • 5H₂O - 0,00026, CaCO₃ - 2,0, твін 85 - 0,3, гідрол - 0,1, екстракт солодових ростків - 1,0, дозволяє отримати глюкозооксидазу в кількості 20 од / мл. Недоліками прототипу є використання в середовищі екстракту солодових ростків - компонента невизначеного складу та низький вихід ферменту [20].

Але був виділений  штам Penicillium funiculosum KM МГУ 433 - продуцент глюкозооксидази, здатний синтезувати глюкозооксидазу за відсутності комплексних органічних речовин невизначеного складу. Новий спосіб отримання позаклітинної глюкозооксидази, що передбачає культивування продукуючого мікроорганізму на живильному середовищі, що містить сахарозу, нітрат калію, дигідрофосфат калію, сульфат магнію, джерела мікроелементів - сульфат марганцю і дистильовану воду, що відрізняється тим, що в поживне середовище додатково вводять гідрофосфат калію , з джерел мікроелементів використовують сульфати цинку і міді (II), хлорид кобальту, молібдат натрію і борну кислоту, при наступному з співвідношенні компонентів, мас.% (у перерахунку на кристалогідратні форми солей):

Сахароза - 8,0-12,0

Нітрат калію - 1,0-4,0

Дигідрофосфат калію - 0,15-0,4

Гідрофосфат калію - 0,15-0,4

Сульфат магнію - 0,05

Вода дистильована - решта

з додаванням мікроелементів, мг • мас. % (у перерахунку на кристалогідратні форми солей):

Cульфат цинку  - 0,4-1,0

Сульфат міді (II) - 0,02-0,1

Сульфат марганцю - 0,5-3,0

Хлорид кобальту - 0,04-0,1

Молібдат натрію - 0,02-0,1

Борна кислота - 0,4-1.0

Виділення глюкозооксидази  з культуральної рідини ведеться відомими методами за допомогою осадження  ферменту сульфатом амонію, подальшого очищення та ліофілізаціі .

 Для підтримки  штаму найкращим середовищем  є сусло-агар з початковим pH 6-6,2. Температура вирощування 25-26℃. На сусло-агарі утворює щільний наліт білого міцелію, поверхня якого в міру спороутворення набуває сірого кольору. Для кращого спороутворення необхідний розсіяне світло [20].

Обгрунтування вибору складу поживного  середовища

Приклади складання  поживних середовищ для вирощування  штаму Penicillium funiculosum KM МГУ 433

Приклад 1

Штам Penicillium funiculosum KM МГУ 433 вирощують на поживному середовищі складу (у%):

Сахароза - 12,0

KNO₃ - 3,0

КН₂РО₄ - 0,15

К₂НРО₄ • 3H₂O - 0,25

MgSO₄ • 7H₂O - 0,05

Водопровідна  вода - решта

Початковий pH - 6,9

Середовище  розливають по 50 мл у конічні колби  об'ємом 750 мл. Стерилізують при 1 атм. Посівний матеріал вирощують в пробірках скошеного сусло-агару. Засів проводять спорами гриба, використовуючи добре заспорену культуру 3-8 тижневого віку. Спори змивають з поверхні агару стерильним 0,1 М фосфатним буфером, приготованим на дистильованій воді. Засіяні колби вирощують на качалці з 180 об  або при 15-26℃. Через 5 діб міцелій відокремлюють від середовища фільтруванням через паперовий фільтр. У фільтраті визначають кількість глюкозооксидази колориметричним методом за методикою, описаною в керівництві [10]. За 1 одиницю глюкозооксидази приймається та кількість ферменту, яка розкладає 1 мікромоль D-глюкози за 1 хв. при pH 7 та 25℃.

У культуральній рідині виявляють глюкозооксидазу в кількості 30 - 35 од / мл. При заміні у вищевказаному середовищі водопровідної води на дистильовану вихід глюкозооксидази становить всього 1 - 2 од / мл. Це свідчить про необхідність мікроелементів для синтезу глюкозооксидази [20].

Приклад 2

Штам Penicillium funiculosum KM МГУ 433 вирощують за прикладом 1, але використовують живильне середовище, приготоване на дистильованій воді, наступного складу (у%):

Сахароза - 8,0

KNO₃ - 3,0

КН₂РО₄ - 0,15

КН₂РО₄ • 3H₂O - 0,25

MgSO₄• 7H₂O - 0,05

Дистильована вода

Початковий pH - 6,9

Поживне середовище використовують з додаванням мікроелементів у різних поєднаннях або без них. Через 5 діб культивування в різних варіантах виявляють різні кількості позаклітинної глюкозооксидази, в середньому значення дорівнює 55 од/мл [20].

Приклад 3

Штам Penicillium funiculosum KM МГУ 433 вирощують за прикладом 2, але в живильне середовище, приготоване на дистильованій воді і містить наступні кількості мікроелементів (в мг): 0,5 ZnS0₄ • 7H₂O; 0,05 CuSO₄ • 5H₂O, 1,0 MnS0₄ • 7H₂O; 0,04 CoCl₂ • 6H₂O; 0,02 Na₂MoO₄ • 2H₂O, 0,4 H₃ВО₃ - вносять різні кількості нітрату калію. При збільшенні концентрації нітрату калію вихід позаклітинної глюкозооксидази зростає . Джерелом сахарози в середовищах служить меляса.

Спосіб може бути використаний і для інших  штамів Penicillium funiculosum, наявні  продуценти глюкозооксидази виду Penicillium funiculosum виявляють наступну активність по пропонованому способу:

P. funiculosum 481К-140 од / мл. P. funiculosum 50К - 70 од / мл. P. funiculosum 238K - 60 од / мл, P. funiculosum 284К - 65 од / мл, P. funiculosum 476K - 65 од / мл. Всі штами, що володіють різним ступенем активності, дали по запропонованому способу глюкозооксидази в кілька разів більше, ніж вхід глюкозооксидази в прототипі (20 од / мл). Максимальна активність спостерігається в межах, пропонованих за даним способом.

Таким чином, пропонований спосіб дозволяє підвищити вихід глюкозооксидази і стандартизувати умови його здійснення [20].

Розрахунок  складу поживного середовища

За 36 годин культивування концентрація глюкозооксидази складає 0,5 г/л, концентрація біомаси 30 г/л.

        Розраховуєм вміст вуглецевого живлення

Потреби для синтезу глюкозооксидази. Як джерело вуглецю для одержання глюкозооксидази використовуєм глюкозу.

Розраховуємо, скільки вуглецю міститься в 100 г глюкозооксидази. Оскільки глюкозооксидаза – це фермент, а ферменти – це, в свою чергу білки, тож, будемо рахувати склад поживного середовища, виходячи з відсоткового співвідношення хімічних елементів у білку.

Припустимо, що у глюкозооксидазі 50 % вуглецю. Отже, у 100 г глюкозооксидази міститься 50 г вуглецю. Далі розраховуємо, у скількох грамах глюкози міститься 50 г вуглецю. Отже, у 180 г глюкози 72 г вуглецю, а 50 г вуглецю містить (180*50)/72=125 г.

В 125 г глюкози  міститься 50 г вуглецю.

Враховуючи, що при вирощуванні мікроорганізмів  на вуглеводах близько 40% субстрату  окислюється до СО₂ для одержання енергії, необхідного для конструктивного метаболізму, вміст глюкози в середовищі становитиме (125×0,4)+125= 175 г/л або 18 % потрібно для одержання 100 г глюкозооксидази.

Потреби для синтезу біомаси. У біомасі міститься 50 % вуглецю, отже вміст вуглецю у 30 г становить 30×0,5=15 г. Ця кількість вуглецю міститься у (15×100)/40=37,5 г цукрів. Враховуючи 40 % втрат на окиснення, для одержання 30 г/л біомаси у середовище необхідно внести (37,5*0,4)+37,5=52,5 г глюкози. Загальна кількість глюкози 52,5+219,1=271,6 г/л

Спочатку вноситься 5 % = 13,58.

Розраховуємо вміст в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що в біомасі міститься 15 % азоту. Таким чином, у 30 г біомаси вміст азоту становить (30× 0,15)= 2 г. Для одержання глюкозооксидази як джерело азоту використовують нітрат калію. Молекулярна маса нітрату калію дорівнює 102, з них азоту – 14. Отже, якщо у 102 г нітрату калію міститься 14 г азоту, то 2 г азоту міститься в (102*2)/14 =14,57.

Потреби для синтезу глюкозооксидази. В 100 г глюкозооксидази міститься 15 г азоту. В 102 г нітрату калію міститься 14 г азоту, в 15 г буде міститися (102*15)/14 =109,3 г нітрату калію. Для одержання 100 г/л глюкозооксидази вмісту нітраут калію повинен становити (102*8,6)/14 =62,66 г/л. з кожною порцією в середовище повинно вноситись (271,6-13,58) = 32,253 г глюкози та 62,66/8 = 7,8325 г нітрату калію

           Розрахунок вмісту фосфору у середовищі

У біомасі міститься  близько 3 % фосфору, отже для синтезу 30 г/л біомаси вміст фосфору повинен становити 30*0,03=0,9 г/л. джерелом фосфору при виробництві глюкозооксидази є К₂НРО₄. Якщо в 174 г К₂НРО₄  міститься 31 г фосфору, то 0,9 г фосфору буде міститися в (174*0,9)/31=5,05 г/л необхідно для синтезу 30 г/л біомаси.

Обгрунтування способу проведення біосинтезу

Існують два основних типи ферментації. Це періодичне культивування (або закрита система) і безперервне культивування (або відкрита система). При періодичному культивуванні всі необхідні інгредієнти вносяться до початку процесу, в ході культивування поживні речовини не додаються і параметри ферментації не змінюються. Саме тому процес називається закритою системою. Коли утвориться достатня кількість продукту, процес зупиняють. Потім вміст ферментеру вивантажують, виділяють продукт, викидають використані мікроорганізми, чистять ферментер і завантажують його для нового культивування.

Безперервне культивування представляє собою довготривалу операцію, що займає багато тижнів, в ході якої поживні речовини додають у середовище в міру їх витрачання, а надлишок культури відбирають. Незважаючи на те, що така ситуація найбільш близька до природних умов, таким, наприклад, як в кишечнику, безперервне культивування має обмежене застосування через високу ймовірність контамінацій.

Безперервне культивування поки не знаходить широкого застосування, проте в даний час все більш популярним стає періодичне культивування з додаванням субстрату, яке представляє собою компроміс між двома системами.

З урахуванням вищезазначеного, вирощування Penicillium funiculosum проводимо глибинним методом з додаванням поживного середовища,  періодично. При періодичному культивуванні мікробні клітини зазнають значних змін протягом усього періоду росту, обумовлені безперервними змінами навколишнього середовища і швидкою реакцією на них клітин.

Даний метод займає проміжне місце між безперервним та періодичним культивуванням. В ньому середовище порціями подається в апарат і порціями відбирається з нього (з ціллю поповнення частково витраченого субстрату чи для активації процесу). Проте в своїй принциповій основі подібні системи залишаються замкнутими, оскільки у них немає постійного відтоку вмісту.

Використання періодичного культивування з додаванням субстрату робить процес більш контрольованим в порівнянні з періодичним культивуванням. Період зростання подовжується за рахунок того, що поживні речовини додаються в низьких концентраціях у процесі ферментації, а не вносяться всі відразу на початку процесу. Однією з переваг методу є можливість регулювання швидкості росту, яку можна порівнювати із швидкістю подачі кисню.

Саме з урахуванням всіх вище перечислених переваг, для культивування мікроорганізму застосовується даний спосіб.

Обгрунтування способу виділення  та концентрування

ферменту глюкозооксидази

Обгрунтування вибору методу осадження

 Для осадження глюкозооксидази використовуються методи осадження органічними полімерами, метод термічної денатурації, а також метод осадження органічними розчинники (етиловий спирт, метанол, поліетиленгліколь, ацетон).

Для осадження ферменту органічними полімерами використовують дорогі, вогненебезпечні і отруйні реагенти, тому потрібно суворо доримуватись відповідних заходів безпеки.

Метод осадження  тепловою денатурацією також потребує суворого дотримання умов проведення процесу (температури, тривалість оброблення, швидкості охолодження і особливо рН середовища). Даний спосіб найчастіше використовується в лабораторних умовах та рідше – на підприємствах.

Найбільш  перспективним є використання етанолу для осадження глюкозооксидази, оскільки процес осадження відбувається при низькій його концентрації (52 – 53%), і препарат містить на 40 – 45% менше баластних речовин, ніж при осадженні іншими спиртами [7].