Диагностика нарушений белкового обмена

Методы  определения общего белка в сыворотке  крови

Белки сыворотки  крови представляют собой гетерогенную группу белков, включающую транспортные белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие. Несмотря на различия в составе, структуре, физических и химических свойствах и выполняемой  функции, белкам сыворотки присущ ряд  общих характеристик:

1. содержат атомы углерода, водорода, кислорода, азота;
2. состоят из аминокислот, соединенных пептидными связями;
3. обладают поглощением в ультрафиолетовой области спектра;
4. сходно ведут себя в ряде химических реакций.

Исходя из этих общих свойств и были разработаны методы определения белка в биологических жидкостях.

Методы определения  общего белка

Среди методов  определения концентрации общего белка  можно выделить несколько основных групп, основанных на различных принципах:

• азотометрические;
• гравиметрические (весовые);
• «преципитационные»;
• спектрофотометрические;
• рефрактометрические;
• колориметрические.

Кроме перечисленных выше разработаны также другие методы, например, флюориметрические, поляриметрические, а также методы атомно-абсорбционной спектрофотометрии и аминокислотного анализа белка. 
 

Азотометрические методы

Азотометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков. Впервые метод был предложен Кьельдалем в 1883 году. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52.

Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости. 

Гравиметрические  методы 

Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании  белков до постоянной массы и взвешивании  на аналитических весах. Методы трудоемки  и в настоящее время практически  не используются для определения  общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в  некоторых лабораториях для определения  фибриногена в плазме крови. 
 

«Преципитационные» методы 
 

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества  факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних  соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии  с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых  результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител. 
 

Спектрофотометрические  методы 
 

Спектрофотометрические  методы определения общего белка  сыворотки крови основаны на измерении  светопоглощения в ультрафиолетовой области.

Растворы белка  обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и  специфичность методов определения  белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

Определение общего белка сыворотки крови с помощью  прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод. 
 
 

Рефрактометрические методы 
 

Рефрактометрические методы определения общего белка  сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке здорового человека, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке. 
 

Колориметрические (фотометрические) методы 
 

Колориметрические методы определения общего белка  основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических  методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного в 1972 г.

Колориметрические методы определения общего белка  сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее  действие некоторых веществ (в том  числе лекарств). 

Другие  методы определения  общего белка сыворотки  крови 
 

Флюориметрические и другие современные методы определения общего белка (например, поляриграфический микрометод или атомно-абсорбционный анализ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако необходимость ввода специальной аппаратуры, а иногда и специальной квалификации аналитика наряду с достаточно высокой стоимостью определения делает этот метод достоянием научно-исследовательских учреждений и значительно ограничивает его использование в клинической лаборатории. 

Методы  определения альбумина  в сыворотке крови. 

Методы определения  альбумина в сыворотке крови можно разделить на две группы: непрямые и прямые. К непрямым методам относят методы, в которых альбумин определяют с помощью различных физико-химических реакций. 

Метод фракционного осаждения. 

Методы основаны на различной способности альбумина  и глобулинов осаждаться в растворах с различной ионной силой. Определение проводят в два этапа. На первом — глобулины осаждают сульфатом аммония, осадок отделяют центрифугированием. На втором — в надосадочной жидкости концентрацию альбумина определяют методом Кьельдаля или с помощью биуретовой реакции. В настоящее время данная группа методов представляет исторический интерес, поскольку они сложны в выполнении, мало специфичны из-за белок-белковых взаимодействий и не поддаются автоматизации.

Определение по содержанию отдельных аминокислот  в молекуле белка основано на способности глиоксиловой кислоты в присутствии ионов Ca²⁺ в кислой среде реагировать с остатками триптофана в молекуле белка с образование окрашенного комплекса. Поскольку содержание триптофана в альбумине сыворотки человека 0,2%, по сравнению с 2–3% в различных γ-глобулинах, различия в содержании триптофана использовали для определения альбумина. Несмотря на то, что в свое время метод был автоматизирован, данный подход к определению альбумина в сыворотке не получил распространения, несмотря на простоту и специфичность метода. 

Электрофорез. 

После разделения белков сыворотки крови на носителе — ацетате целлюлозы или агарозе, фиксации и окраски процентное соотношение между различными фракциями рассчитывают с помощью денситометрии. Концентрацию альбумина определяют исходя из концентрации общего белка в исследуемом образце сыворотки и процентного содержания альбумина. Метод является трудоемким и приводит к завышению концентрации альбумина, поскольку он обладает более высоким сродством, по сравнению с другими белками сыворотки крови, практически ко всем известным красителям. 

Органические  анионы и красители.  

Данная группа методов основана на образовании  комплекса альбумин-краситель и  смещении максимума поглощения реакционной  среды. Это позволяет проводить  фотометрию в присутствии избытка  красителя, необходимого для насыщения  всех связывающих сайтов альбумина, что позволяет всем молекулам  альбумина принимать участие  в реакции. Бромкрезоловый зеленый для определения альбумина был предложен F. Rodkey в 1965. Реакцию обычно проводят при pH 4,2–4,5, фотометрию осуществляют при 620–630 нм 

Технология «сухой» химии.  

В тест-полосках, предназначенных для определения альбумина в сыворотке человека, в качестве реактива использован БКЗ. Интенсивность окраски цветного комплекса определяют с помощью отражательной фотометрии.

К прямым методам  определения альбумина следует  отнести методы, в которых используют специфичные к человеческому  альбумину антитела.

В иммунохимических методах для определения альбумина в сыворотке чаще используют радиальную иммунодиффузию (РИД). При этом альбумин диффундирует в стационарной фазе — агарозе, содержащей антитела к альбумину. Линии преципитации, образующиеся в реакции между альбумином и антителом, фиксируют и окрашивают. Концентрацию альбумина в образце рассчитывают с помощью калибровочного графика путем сравнения диметра образованного кольца с диаметром колец, образованных при анализе образцов альбумина с известной концентрацией.

Ход реакции  между альбумином и антиальбуминовыми телами может быть оценен с использованием классических фотометрических методов. Комплексы альбумин—антитело способны либо поглощать (турбидиметрия), либо рассеивать (нефелометрия) световой поток в зависимости от концентрации альбумина в исследуемом образце. Данная группа методов адаптирована ко многим автоанализаторам. По мнению большинства исследователей, иммунохимические методы определения альбумина в сыворотке крови обладают высокой специфичностью и могут использоваться для анализа различных жидкостей организма, в которых концентрация альбумина низкая, в частности моча или спинномозговая жидкость. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ГОУ ВПО ОМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

КАФЕДРА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИ И КЛИНИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ