Полициклические ароматические углеводороды: проведение контроля окружающей среды

     Сланцевые смолы имеют весьма сложный состав, который слабо изучен. Они содержат множество полициклических ароматических  углеводородов (полиаренов), суммарно - до 10%. Известно, что некоторые полиарены являются сильнейшими канцерогенами. Однако содержание индивидуальных полиаренов в производстве или при использовании смол практически не контролируется, так как обычные методики анализа смол включают трудоемкое многоступенчатое отделение неуглеводородных компонентов.

     В более простых объектах полиарены  определяют, получая квазилинейчатые спектры низкотемпературной люминесценции (НЛ) и измеряя интенсивность соответствующих квазилиний, однако применимость этого метода к смолам проблематична. Так как стандартные образцы смол с известным содержанием полиаренов не выпускаются, то для проверки точности предлагаемых методик сопоставляют результаты анализа одних и тех же проб, полученные разными способами в разных лабораториях. В данном случае исследования проводили параллельно в лаборатории скрининга канцерогенов ОНЦ АМН (Москва) и в Омском госуниверситете без обмена данными до окончания работы. Одновременно разрабатывались два варианта люминесцентно-спектрального метода, отличающиеся способом возбуждения НЛ пробы и принципом отбора аналитических линий в спектрах испускания.

     В методике А, первоначально разработанной  для аэрозолей , искомые полиарены  возбуждали поочередно УФ-светом Хе-лампы  на длинах волн, соответствующих максимумам в их спектрах поглощения. При этом записывали узкие участки спектра  испускания НЛ, чтобы в них попали 1-2 наиболее интенсивные квазилинии определяемого соединения (в виде пиков на регистрограмме). При идентификации учитывали положение, форму и относительную интенсивность пиков.

     В методике Б, ранее разработанной  в ОмГУ для анализа подземных  вод [4], применяется импульсное излучение  азотного лазера (337,1 нм), возбуждающее (с разной эффективностью) почти  все полиарены. Единый режим возбуждения  легче осуществим на практике, но приводит к очень сложным спектрам испускания НЛ (порядка 200 линий в интервале 360-500 нм). Компьютерную идентификацию  всех люминесцирующих полиаренов вели, причем основное внимание обращалось на положение квазилиний в спектре  испускания. Используемые спектрофлуориметры позволяли установить положение линий в спектрах НЛ с погрешностью, не превышающей 0,2 нм.

     В настоящей работе исследовалась  сланцевая смола Кохтла-Ярве, аналогичная  применяющимся в литейном производстве смолам ГТФ.В ходе пробоподготовки  навеску смолы растворяли в смеси  бензола и ацетона (4:1), хроматографировали в тонком слое Al2O3, готовили н-парафиновые  растворы фракций (10-4 г/мл), замораживали полученные растворы при 77 K и снимали  спектры НЛ. Количественное определение  в обоих случаях вели по способу добавок. Для повышения точности анализа по методике А интенсивность аналитических линий нормировали по линиям другого полиарена (внутренний стандарт) или по фону, что приводило к sr = 0,10 - 0,15. В методике Б нормировали сигнал по рассеянному матрицей возбуждающему излучению лазера (0-1 переход), в этом случае воспроизводимость несколько лучше, sr = 0,05-0,10, независимо от природы определяемого полиарена.

     Независимо  от режима возбуждения спектры НЛ неразделенной сланцевой смолы  при 77 К содержат очень сильный  диффузный фон, маскирующий квазилинии индивидуальных полиаренов. Чтобы уменьшить  погрешности, связанные с одновременным  присутствием десятков структурнородственных полиаренов в пробе сложного состава (наложения линий разных компонентов, мощный фон и др.), необходимо предварительное фракционирование пробы, при этом важно выбрать минимально необходимую степень фракционирования.

     Предварительное отделение асфальтенов и неароматических  компонентов по известным методикам снижает фон, но без разделения суммы полиаренов не устраняет его в требуемой степени.

     После разделения пробы на 5 фракций методом  тонкослойной хроматографии на Al2O3 спектры смол становятся значительно информативнее, фон снижается до приемлемого уровня даже без деасфальтизации. По нашему мнению, роль Al2O3 заключается не только в разделении суммы полиаренов, но и в частичном отделении окисленных ароматических соединений, которые при хроматографировании остаются на линии старта. Известно, что карбонил- и карбоксилпроизводные полиаренов дают диффузные спектры НЛ, и отделение их ведет к существенному повышению информативности спектров сложных смесей. Фракционирование представляется необходимой стадией анализа, независимо от выбора последующих операций (как и в анализе нефтей).

     Предварительное фракционирование существенно влияет на точность анализа. Так, найденное  по методике Б содержание пирена без  фракционирования было 0,12 - 0,13%, а суммарное содержание пирена во всех 5 фракциях составляло 0,23%. Это совпадает с данными, полученными в Москве по методике А. Более детальное фракционирование пробы (10-15 узких фракций) не изменяло далее этот результат. Аналогичные результаты получены и по другим соединениям. Следовательно, принятая нами глубина фракционирования сланцевой смолы необходима и достаточна.

     Качественный  состав проб. По методике А в сланцевой  смоле было обнаружено 16 голоядерных  полиаренов (суммарно во всех фракциях). Эти соединения содержат от 3 до 7 сопряженных  циклов, некоторые из них (бенз[a]пирен  и дибенз[а,h]антрацен), являются сильными канцерогенами. 12 соединений из этих 16 были опознаны ЭВМ и по методике Б. В каждой из фракций смолы было обнаружено от 3 до 8 полиаренов, некоторые  структуры обнаруживались одновременно в двух и даже в трех фракциях, что может указывать на присутствие  спектрально неразличимых соединений с разной хроматографической подвижностью (например, алкилированных и неалкилированных соединений с одним и тем же ароматическим ядром). Совпадение результатов качественного анализа смолы при двух принципиально различных способах идентификации подтверждает надежность метода. Расхождения по 4 компонентам (из 16) могли объясняться неодинаковыми пределами обнаружения соответствующих полиаренов в методиках А и Б: возбуждение при 337,1 нм для некоторых соединений малоэффективно.

     Машинная  обработка спектров, полученных по методике Б, позволила дополнительно выявить в сланцевой смоле 19 полиаренов (в основном алкилированных). Поиск таких соединений в методике А не предусмотрен, но в родственных объектах (каменноугольная смола и др.) они неоднократно обнаруживались. Среди дополнительно идентифицированных ЭВМ соединений также были сильные канцерогены, в частности, 20-метилхолантрен и метильные производные бенз[а]пирена. Если по методике А был опознан собственно тетрафен, то с применением ЭВМ были выявлены 4 его метильных производных, отличающиеся значительно большей канцерогенной активностью. Отметим, что надежность компьютерной идентификации алкилированных соединений несколько ниже, чем голоядерных. Это можно объяснить сходством (а следовательно, меньшей характеристичностью) эталонных спектров НЛ у соединений с тем же ароматическим ядром и разными алкильными заместителями или разным положением одного и того же заместителя. Установить, какие именно алкилированные структуры присутствуют в подобных смесях, можно только с применением ЭВМ.

     Результаты  определения некоторых полиаренов в смоле по методикам А и Б (суммарно по всем фракциям) 

     Количественный  анализ. Количественно определяли лишь 15 соединений, так как особо тяжелые и замещенные полиарены промышленностью не выпускаются, и соответствующие эталоны труднодоступны. Это же обстоятельство препятствует многократному дублированию опытов при работе по методу добавок. В качестве примера в таблице приведены результаты анализа смолы по 4 соединениям. Средние значения, полученные по методикам А и Б (при одинаковой пробоподготовке), для большинства соединений различаются лишь на 10 - 20 % отн., то есть расхождения статистически незначимы. Это подтверждает правильность анализа. Лишь для двух соединений из 15 - для флуорантена и бенз[е]пирена - результаты достоверно различаются (в 1,5 - 2 раза), что можно объяснить неучтенными межэталонными наложениями, то есть неудачным выбором аналитической линии в одной из методик. Отметим, что для количественного определения каждого полиарена использовали: в методике А - наиболее интенсивные, а в Б - наиболее характеристические линии (не совпадающие с линиями в эталонных спектрах испускания других компонентов). При отборе таких линий ЭВМ учитывает качественный состав пробы.

     Найденные содержания индивидуальных полиаренов лежат в интервале от 0,01 до 0,5 % от массы смолы. При этом содержание особо опасного канцерогена - бенз[а]пирена - на порядок превышает допустимую по гигиеническим нормативам величину.

     Таким образом, разработанные методики спектрально-люминесцентного  анализа позволяют идентифицировать и количественно определить широкий  круг индивидуальных полиаренов (в  том числе сильных канцерогенов) даже в таком сложном объекте, как сланцевая смола, причем при минимальной пробоподготовке. Очевидно, что методика А, направленная на поиск приоритетных соединений, и методика Б, нацеленная на выявление полного состава пробы, хорошо дополняют друг друга. При этом такие канцерогены, как бенз[а]пирен и дибенз[a,h]антрацен надежно опознаются и точно определяются по обеим методикам. Разработанные методики могут быть применены. для контроля за содержанием канцерогенов на предприятиях, производящих или применяющих сланцевые смолы.

     Проблема  ПАУ и их содержание в природных средах [23]

     ПАУ (полициклические ароматические  углеводороды) образуются при неполном сгорании органических веществ. Воздействие  ПАУ на человека происходит при вдыхании загрязненного воздуха, табачного  дыма, приеме загрязненной воды и пищи, а также при попадании на кожу сажи, смолы, нефти. Долгое время предполагалось, что ПАУ представляют только потенциальную опасность для здоровья человека; теперь установлено, что многие представители этого класса являются канцерогенами и (или) мутагенами. Из 16 соединений этой группы, подлежащих определению, наиболее распространенным является нафталин, а наиболее токсичным 3,4-бенз(а)пирен (его ПДК в воде составляет 0.005 мкг/л, в почве 0.02 мкг/л, в воздухе 0.1 мкг/100м³). Из-за высокой токсичности 3,4-бенз(а)пирена его определение входит в программы глобального мониторинга загрязнений ОС.

     Поступление ПАУ в окружающую среду обусловлено, в основном, сжиганием каменного  угля, работой мусоросжигающих печей  и двигателей на бензине или дизельном  топливе. Много их накапливается  в атмосфере при лесных пожарах, в результате вулканической деятельности.

     По  данным постов наблюдения Гидрометеослужбы в Кузбассе за 1996 год высокое загрязнение  атмосферы 3,4-бенз(а)пиреном наблюдалось  в городах Кемерово, Новокузнецк, Прокопьевск. В частности, в Кемерово среднегодовая концентрация 3,4-бенз(а)пирена превышала ПДК в 5,4 раза. Наибольшее загрязнение этой примесью отмечается в правобережной части города (Кировский район), находящейся под влиянием выбросов промышленных предприятий Заводского и Кировского районов. На посту данного района средняя концентрация составила 7,3 ПДК; максимальная за год по Кузбассу отмечена здесь же (20,4 ПДК). Нафталин обнаружен не был. Наибольшее загрязнение наблюдается в период отопительного сезона. В 1995 г. было отмечено превышение ПДК в 7,9 раз, в 1990 г. - в 3,9 раз (данные по Кировскому району). В Новокузнецке наибольшее загрязнение данным ПАУ наблюдается в центре города (до 9,7 ПДК), в целом по городу средняя концентрация составляет 4,3 ПДК. Таким образом, основные источники загрязнения 3,4-бенз(а)пиреном в Кузбассе - крупнейшие металлургические предприятия, котельные и ГРЭС, отопительные печи частного сектора и транспорт.

     Сведения  о содержании ПАУ в воде и почве  крайне ограничены. Для определения  ПАУ международными стандартами  рекомендуются следующие методы: КГХ\МС, ВЭЖХ\УФ и/или ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. В работе приводятся данные по отработке методики определения нафталина и 3,4-бенз(а)пирена в воде на жидкостном хроматографе фирмы Varian с использованием УФ детектора на диодной матрице и флуоресцентного детектора.

     Определение полихлорированных  бифенилов (пхб)в  воде, почве и биологических  объектах методом  перхлорирования  и ГХ-ЭЗД [24]

     Большинство современных загрязнений природных  и промышленных объектов ПХБ обусловлены  применявшимися ранее их промышленными  смесями, состав которых известен и  постоянен. Поэтому, для оценки уровней  загрязнения природных и промышленных объектов, можно определять суммарное содержание ПХБ, периодически корректируя полученные данные стандартными методами анализа.

     Для определения суммарного количества ПХБ нами предложен метод, основанный на реакции перхлорирования (исчерпывающего хлорирования) всех конгенеров ПХБ  с образованием единственного соединения декахлорбифенила (ДХБ), определение которого осуществляется методом ГХ-ЭЗД. Для проведения реакции нами предложен новый реагент, который представляет собой смесь опилок дюралюминия, серы, хлористого сульфурила и Aliquat-336. При 105^оС за 35 минут достигается 91-97% выход ДХБ при введении в реакцию смеси ПХБ «Совол» в количествах от 10 нг до 200 мкг.

     В качестве внутреннего стандарта  используется 4-фтордифениловый эфир, который вводится в образец перед  экстракцией и проходит все стадии пробоподготовки и анализа, включая  перхлорирование.

     В экспериментах с перхлорированием экстрактов воды с введенными ПХБ («Совол» - 16 – 16000 нг) показано, что отклонения найденных количеств ПХБ не превышает 15% от изначально введенных количеств. Также показана возможность применения разработанной методики в качестве скрининговой для определения суммарного содержания ПХБ в пробах почв и биологических объектов.

     Определение полиароматических  углеводородов в  продуктах питания  и объектах окружающей среды методом  поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

     Полиароматические углеводороды (ПАУ) - класс органических соединений, для которых характерно наличие в химической структуре двух и более конденсированных бензольных колец. В продуктах питания и объектах окружающей среды встречаются до 16 таких соединений ПАУ, которые классифицируются как приоритетные загрязнители. В настоящее время ПАУ определяют методами ГЖХ или ВЭЖХ. Эти методы продолжительны во времени и малопроизводительны, требуют дорогостоящего оборудования, трудоемкой пробоподготовки образцов (очистка, концентрирование и дериватизация) и большого количества органических растворителей и других реагентов. Поэтому для быстрого скрининга ПАУ необходимо разрабатывать другие аналитические методы. Иммуноферментный анализ (ИФА) и флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (ФПИА) становятся все более часто используемыми методами, которые дополняют хроматографические методы для скрининга большого числа загрязнителей. ФПИА это метод конкурентного иммуноанализа, который основан на возрастании поляризации флуоресценции небольших флуоресцеин-меченных молекул антигена (трейсеров) при их взаимодействии с специфическими антителами. Если в тестируемом образце содержится немеченый аналит, то трейсер будет конкурировать с ним за связывание с антителами и значение поляризации флуоресценции будет уменьшаться. Для выполнения ФПИА необходимо к тестируемому образцу (обычно 10-50 мкл) просто добавить растворы трейсера и антител, перемешать и измерить аналитический сигнал. Поляризация флуоресценции реакционной смеси измеряется в течении нескольких секунд. Общее время для проведения анализа составляет от секунд до нескольких минут в зависимости от используемых пипеток и прибора для измерения поляризации флуоресценции. В данной работе были синтезированы флуоресцеин-меченные трейсеры для различных ПАУ и разработаны методики ФПИА с использованием моноклональных и поликлональных антител. Пределы обнаружения ПАУ для бензопирена, нафталина и антрацена были 0.9, 1.1 и З,4 нг/мл, соответственно. Метод ФПИА может быть использован для быстрого скрининга продуктов питания и объектов окружающей среды на загрязнение ПАУ.