Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

  Таблица 5

  Влияние различных концентраций гентамицина на показатели мутности  нативного  и модифицированного  IgG при термообработке (ОП 540 нм (х±σ))

Примечание: x - ср. арифметическая, σ – стандартное отклонение, n=5.

Концентрация  IgG в образцах -5 мг/мл.

  Таблица 6

  Влияние различных концентраций гентамицина на показатели вязкости нативного  и модифицированного  IgG при термообработке

  Примечание: x - ср. арифметическая, σ – стандартное отклонение, n=5.

Концентрация  IgG в образцах -25 мг/мл. Вязкость определяли относительно воды (отношение расстояний, пройденных водой и исследуемым веществом в капиллярах одинакового сечения при одинаковом приложенном давлении капилляре за один промежуток времени).

      Как видно из таблиц, только по изменению  мутности можно однозначно судить об усилении денатурирующего эффекта  термообработки при увеличении концентрации гентамицина. Кроме того прослеживается тенденция повышения устойчивости модифицированной формы IgG к коагуляции при увеличении мольного избытка совиаля, т.е. в данном эксперименте подтвердили ожидаемое повышение термостабильности IgG при модификации совиалем.

     Для последующих опытов использовали образцы, термоинактивированные при концентрации гентамицина 10 мг/мл, так при этой концентрации не происходило желирования модифицированного IgG во всех исследуемых соотношениях белок-полимер (см. таблицы 5,6). 

  3.4.2. Исследование зарядовых характеристик модифицированных форм специфического BIgG 

     Как уже упоминалось, при модификации совиалем происходит экранирование положительно заряженных боковых радикалов аминокислот в составе молекулы BIgG, в основном, ε-аминогрупп лизина. Учитывая электронейтральность матрицы совиаля, при модификации в результате перераспределения зарядов на поверхности химерной конструкции должна изменяться ее изоэлектрическая точка, причем в сторону более низких значений по сравнению с pI нативного BIgG.

     По  некоторым данным изменением изоэлектрической точки модифицированных молекул  определяется степень их иммуногенности. В случае иммуноглобулинов, модификация  также трансформирует их биологическую  функцию, касающуюся не только антигенсвязывающей способности, но и эффекторных функций, таких как связывание комплемента, опсонизация и т.п. Как уже упоминалось, модификация совиалем затрагивает  в основном тяжелые цепи иммуноглобулина, а значит в большей степени Fc-фрагмент, участвующий в реализации как раз эффекторных функций IgG.

     Исходя  из вышесказанного, изучение изменения  зарядовых характеристик специфического BIgG при модификации может дать важную информацию для исследований иммунологических и фармакокинетических свойств химерных форм иммуноглобулинов.

     В качестве сравнительного метода оценки смещения pI у модифицированных форм, использовали электрофорез в агарозе в щелочной буферной системе при рН 8,3. В данных условиях исследуемый BIgG, полученный анионообменной хроматографией в режиме сорбции примесных белков при рН=8,0, обладает очень низким отрицательным зарядом. Поэтому с учетом неоднородности BIgG фракции по pI и наличия влияния электроэндоосмоса иммуноглобулин в электрофорезе будет двигаться к аноду очень медленно, а часть молекул может мигрировать и к катоду. Таким образом, в данных условиях проведения электрофореза, изменения заряда модифицированных молекул будут отчетливо отражаться на скорости их миграции к аноду.

   +

   1           2          3         4

  Рис. 4. Электрофорез модифицированных форм BigG в агарозе. Анод внизу.

1. Нативный BIgG (щелочная фракция BIgG)                  3. BIgGmod 1/3
2. BIgGmod 1/1       4. BIgGmod 1/5

      По результатам электрофореза  в агарозе (см. Рис. 4 ) можно сделать вывод о том, что при модификации совиалем происходит снижение изоэлектрической точки BIgG, и наблюдается обратная зависимость pI от степени модификации. Кроме того, при увеличении степени модификации повышается однородность исследуемых форм по заряду. Как уже отмечалось, молекулы исследуемого нативного BIgG обладают изначально некоторым разбросом по изоэлекрической точке и движутся в агарозном электрофорезе с неодинаковой скоростью, а с учетом электроэндоосмоса молекулы с низким отрицательным зарядом (при рН буфера равном 8,3) могут двигаться в сторону катода. Поэтому при увеличении степени модификации усиливается экранирование заряженных группировок на поверхности молекулы и наряду с увеличением отрицательного заряда происходит некоторое «уравнивание» суммарных зарядов модифицированных молекул и сужение зоны миграции. Таким образом, в данном эксперименте подтвердились предположения о снижении изоэлектрической точки молекулы IgG при модификации совиалем.

     Для объективной количественной оценки изменения зарядовых характеристик  BIgG при модификации совиалем полученные конструкты необходимо исследовать в двумерном электрофорезе, позволяющем помимо определения изоэлектрической точки определить спектр молекулярных масс исследуемых образцов. 
 
 
 
 
 
 

Выводы

   По  результатам проделанной работы были сделаны следующие выводы:

1. Получили очищенный (свыше 95% электрофоретической однородности) IgG быка, специфичный к вирусу инфекционного ринотрахеита.
2. Получили модифицированные формы IgG быка, обладающие повышенной термостабильностью и устойчивостью к действию денатурирующих агентов, которые повышаются с увеличением мольного избытка совиаля в химерной молекуле.
3. Объективная количественная оценка степени модификации иммуноглобулина G быка совиалем затрудняется вследствие значительной гетерогенности полученных модифицированных форм по молекулярно-массовому распределению.
4. Изоэлектрическая точка химерной молекулы понижается с увеличением мольного избытка совиаля.

Литература