Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ 

«УДМУРТСКИЙ ГОСУДАРСТВННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» 

     факультет медицинской биотехнологии

     Кафедра биохимии

     Специальность 012300 Биохимия 
 
 

Курсовая  на тему

   «Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров полученных модифицированных форм»

 
 
 
 
 
 
 
 

Работу  выполнила

студентка ФМБТ группы 30-41

Чернова Е. С. 
 

Научный руководитель

инженер УНЛ молекулярной биологии и диагностики  ФМБТ

В.А. Храмов  
 
 
 
 
 
 
 

Ижевск 2010 г.

Содержание 

Список сокращений                                                                                            3

Введение                                                                                                               4

Глава I. Обзор литературы.                                                                                 7

1. Общая характеристика иммуноглобулина G быка и его подклассов                                                                                        7
2. Методы выделения и очистки IgG быка                                      12

1. Нехроматографические методы выделения                    13
2. Хроматографические методы выделения                        16

3. Методы тестирования чистоты образцов                                     17
4. Химическая модификация и ее влияние на физико-

химические  и биологические свойства белков                            18

1. Модифицирующие агенты и методы конъюгации         19
2. Влияние модификации на структуру и свойства

белков                                                                                  23

Глава II. Материалы и методы                                                                            25

Глава III. Результаты и их обсуждение                                                              28

            3.1.     Выделение IgG КРС                                                                       28

            3.2.     Модификация BIgG, специфичного к ИРТ, сополимером ПВП

                       с диацеталь акролеином (совиалем)                                             31

            3.3.     Количественная оценка степени модификации                           34

            3.4.     Исследование свойств модифицированных форм специфического BIgG до и после термообработки                      39

                          3.4.1. Влияние концентрации ГМ на степень тепловой денатурации нативного и модифицированного BIgG   39

                         3.4.2. Исследование зарядовых характеристик  модифицированных форм BIgG                                      41

Выводы                                                                                                                   44

Литература                                                                                                             45 

Список  сокращений

АоХр                                                          Анионообменная хроматография

ГМ            Гентамицин

ДР                                                              Десорбирующий раствор

ИФА            Иммуноферментный анализ

ДЭАЭ-целлюлоза                                     Диэтиламиноэтил-целлюлоза

ИРТ             Инфекционный ринотрахеит

ИЭТ (pI)                                                    Изоэлектрическая точка

кДа                                                             Килодальтон

КМ-целлюлоза                                         Карбоксиметил-целлюлоза

КРС                                                           Крупный рогатый скот

Н/о                                                            Надосадок

Ос                                                             Осадок

ОП                                                            Оптическая плотность

ПЭГ                                                          Полиэтиленгликоль

СР                                                            Стартовый раствор

ЭФ-ПААГ                                                Электрофорез в полиакриламидном геле

ЭХр                                                          Эксклюзионная хроматография

BIgG                                                         Иммуноглобулин G быка

SDS                                                          Додецилсульфат натрия 
 
 
 
 
 
 
 

Введение 

     Одним из способов повышения термостабильности  физиологически активных веществ полипептидной  природы является химическая модификация. А, как известно, именно термообработка служит одним из самых эффективных способов вирусной инактивации. Для инактивации практически всех известных вирусов достаточно инкубации в течение 10-24 часов при 60 °C [1]. Однако тепловое воздействие вызывает денатурацию (агрегацию, коагуляцию, разрушение нативной конформации) действующего начала препарата, т.е. белка, что ведет к потере его биологической функции, что особенно актуально в случае иммуноглобулиновых препаратов направленного действия, так как иммуноглобулины являются термолабильными белками.

     Химическая  модификация уже многие десятилетия  используется для целенаправленного  изменения свойств белков [2]. Эти изменения направлены как на приобретение стабильности белковым препаратам при хранении и при воздействии внешних условий среды и денатурирующих агентов [3], так и на возможное изменение функциональности биологических макромолекул [4].

     Широкое использование в качестве носителей  при модификации физиологически активных веществ получили карбоцепные  полимеры, характеризующиеся простотой  синтеза и большой возможностью варьирования структуры [5]. Наиболее известным представителем карбоцепных полимеров, имеющих поли-N-виниламидное строение, является поли-N-винилпирролидон, обладающий биологической совместимостью и весьма низкой токсичностью [6,7]. С этой точки зрения поли-N-винилпирролидон и его сополимеры представляют собой подходящую основу для синтеза конъюгатов с белками и, в частности, с иммуноглобулинами класса G, как основными носителями антительной активности в организме.

     Еще один прикладной аспект получения модифицированных форм физиологически активных белков – это создание пролонгированных форм биопрепаратов, обладающих повышенной устойчивостью к биодеградации  и потому удлиненным периодом персистенции в организме, дающим возможность  белку длительное время осуществлять свои функции.

     Отметим первоочередную необходимость разработки иммуноглобулиновых препаратов, направленного действия, обладающих противовирусной активностью, так как вирусные инфекции сложнее поддаются лечению и с большей вероятностью вызывают осложнения, оказывая, в том числе, генотоксичекий эффект, по сравнению с заболеваниями иной природы.

     Таким образом, предполагается  возможность  создания модифицированной формы иммуноглобулина  G, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, которая будет устойчива к действию денатурирующих условий, в частности, к тепловому воздействию.

     Цель  данной работы: получение модифицированных форм иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита КРС, и исследование их физико-химических свойств.

   В рамках цели были выделены следующие  задачи:

1. выделить иммуноглобулин G быка, специфичный к вирусу инфекционного ринотрахеита КРС;
2. провести модификацию специфического BIgG сополимером поливинилпирролидона с диацетальакролеином;
3. исследовать физико-химические свойства полученных модифицированных форм BIgG:

– степень модификации;

– термостабильность образцов в присутствии денатурирующего агента (гентамицина) и без него;

– зарядовые характеристики модифицированных форм. 

 

      Глава I. Обзор литературы 

      1.1. Общая характеристика иммуноглобулина G быка

      и его подкласcов 

      Иммуноглобулин G быка (IgG быка) в основе своей представлен  мономерными (за исключением случаев  самоагрегации, особенно характерной  для IgG1) 7S-молекулами с типичным для IgG млекопитающих доменным строением [42]. Его молекулярная масса по данным разных исследователей от 146 до 172 кДа, содержание в иммуноглобулиновой фракции  сыворотки крови КРС – 80% [50], по данным других авторов - 87% [79] и 86% [42].

      Молекула IgG состоит из двух тяжелых (H) и двух легких (L) цепей, связанных между  собой дисульфидными мостиками [3]. Каждая из цепей состоит из вариабельной и константной областей (V-, C- соответственно) [13, 20].

      Ферменты, например папаин, способны расщеплять молекулу IgG на три фрагмента. Два  из них, обозначаемые как Fab, имеют в  своем составе вариабельные области  и сохраняют способность реагировать  с антигеном [13, 20]. Отдельные участки  вариабельных областей отличаются особым разнообразием; эти гипервариабельные  области локализованы на трех фрагментах легкой цепи и на трех фрагментах тяжелой [20]. Третий фрагмент, обозначаемый как Fc, состоит из части константной  области тяжелых цепей и способен к таким эффекторным функциям, как связывание комплемента, реакция  с рецепторами лейкоцитов [35]. Fab- (Fragment antigen binding) и Fc- (Fragment crystallizable) фрагменты, являющиеся в целом компактными  образованиями, связаны друг с другом гибкими отрезками тяжелой цепи, не образующими регулярных структур из-за высокого содержания остатков пролина. Этот участок, называемый шарнирной областью, легко расщепляется под действием различных протеолитических ферментов, хотя большая степень гликозилирования данной области для IgG быка по сравнению с IgG кролика и человека обуславливает большую устойчивость IgG быка к протеолизу [8, 41, 69]. Кроме того, углеводные компоненты играют важную роль в поддержании конформации доменов и молекулы в целом [27].

      В водных растворах вследствие относительно малой компактности шарнирной области  молекула IgG принимает Y-образную форму (где верхние отрезки представляют собой Fab-фрагменты, а нижний – Fc-фрагмент), благодаря наличию угла между Fab-участками [13, 20].