Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

      Активный  центр, или антидетерминанта (combining site) представляет собой щель, хотя и не всегда, расположенную между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи [8]. В активный центр входит тот отрезок тяжелой цепи, который попадает в Fab-фрагмент [10, 35]. И поэтому полное представление о строении контактирующей области можно получить при анализе трехмерной структуры Fab-фрагмента. Гипервариабельные участки группируются на одном конце молекулы, что делает их полностью доступными растворителю [10].

     Результаты  многочисленных исследований гетерогенности IgG быка позволяют говорить о существовании трех подклассов IgG быка: IgG1, IgG2a и IgG2b по серологической классификации Butler J.E. (1987) или IgG1, IgG2, IgG3 соответственно по генетической классификации Knight K.L. (1988) [64].

      Третий  подкласс IgG быка был впервые обнаружен Butler J.E. (1987) с помощью кроличьих и козлиных подкласс-специфических поликлональных иммунореагентов. Он выявлялся в виде отдельной популяции молекул IgG, коэлюируемых с DEAE-целлюлозы вместе с IgG1 и с частью IgG2 (IgGa), и был предварительно обозначен как IgG2b [59, 60]. В дальнейшем были секвенированы нуклеотидные последовательности, кодирующие различные цепи иммуноглобулинов быка разных классов и подклассов, и собраны банки данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях этих цепей.

      Гены, кодирующие констатную область тяжелых  цепей иммуноглобулинов быка, расположены  в следующем порядке 5’- JH – 7 Кб – m - 5 Кб – d - 33 Кб – g3 – 20 Кб - g1 – 34 Кб - g2 – 20 Кб - e - 13 Кб - a - 3’ и занимают около 150 Кб (килобаз, тысяч пар оснований) длины ДНК. Для них характерен выраженный полиморфизм, обеспечивающий аллотипическое разнообразие антител [82].

      В отличие от подклассов IgG других млекопитающих между С_H-доменами подклассов IgG быка имеются значительные структурные различия, которыми в свою очередь объясняются ярко выраженные антигенные и физико-химические различия между подклассами. Идентичность константной области тяжелых цепей IgG1 и IgG2, IgG1 и IgG3, IgG2 и IgG3 составляет соответственно 84%, 80% и 79% [63, 71, 74]. Для сравнения, идентичность CH-области IgG1 овцы и IgG1 быка составляет 87% [44, 51, 63]. В отношении IgG1 и IgG2 быка имеются данные по идентичности аминокислотной последовательности между отдельными доменами CH-области: 96%, 80%, 83% для СН1, СН2, СН3 соответственно [74]. Между аллотипами отдельных изотипов IgG быка могут наблюдаться значительные структурные различия. Так для IgG2a и IgG2b–аллотипов они касаются СН1-, СН3-, и, особенно, шарнирной области (сходство между аллотипами в этом регионе всего 71,4%) [59, 60]. Меньшая гибкость шарнирной области IgG2a и меньшая степень гликозилирования CH2-домена наряду с различиями в других доменах обуславливают пониженную способность антител данного аллотипа фиксировать комплемент, что отражается в более высокой восприимчивости животных с IgGa-аллотипом к пиогенными инфекциями [40]. Информация об IgG3 быка пока довольно ограничена. Многие исследователи при изучении IgG быка по-прежнему опираются на устоявшуюся классификацию, основанную на различиях в заряде молекул различных подклассов. В соответствии с ней IgG быка подразделяется на два крупных подкласса: IgG1 и IgG2 ( табл. 1 ), которым может быть также присвоен статус инфраклассов. Я в своей работе также буду придерживаться данной классификации, и ниже иммуноглобулин G быка рассматривается, исходя из представлений о делении этого гетерогенного класса белковых макромолекул на два подкласса.

      Как уже упоминалось выше, между подклассами  IgG быка имеются выраженные различия в физико-химических свойствах. В первую очередь это касается заряда молекулы. Разницу в заряде хорошо иллюстрирует поведение подклассов IgG быка в процессе анионобменной хроматографии. IgG2 практически полностью, но не абсолютно, элюируется с анионообменника стартовым буфером в виде так называемого транзитного пика. IgG1 десорбируется при более высокой ионной силе. Следует отметить, что в зависимости от условий опыта небольшое количество IgG1 может обнаруживаться в транзите, так же как некоторая часть популяции IgG2 -элюироваться вместе с мажорной фракцией IgG1 при большей ионной силе. Это объясняется перекрыванием зарядов между частью IgG1, характеризующейся повышенным значением ИЭТ, и частью IgG2, обладающей более низкой ИЭТ, чем основная доля молекул IgG2, что обнаруживается при изоэлектрическом фокусировании рассматриваемых подклассов [41, 50, 62]. По данным изоэлектрического фокусирования в ПААГ изоэлектрические точки (pI) IgG1 и IgG2 варьируют в интервалах рН: 5,5 – 6,8 и 7,5 – 8,3 соответственно [62].

      По  массе γ₁-цепи несколько больше γ₂-цепей; этим, вероятно, обусловлена разница в размерах интактных молекул IgG1 и IgG2, а также более низкая скорость диффузии и подвижность в ЭФ-ПААГ молекул IgG1 по сравнению с IgG2 [41, 62]. Молекулярные массы L-цепей разных подклассов IgG быка по данным ЭФ-ПААГ идентичны [41].

      Подклассы IgG быка имеют разную чувствительность к протеолизу пепсином и трипсином: IgG2 более резистентен к действию пепсина, IgG1 – к действию трипсина. Протеолиз папаином дает не менее пяти фрагментов. Различия в протеолизе папаином между подклассами IgG быка незначительны. Особенности протеолиза подклассов IgG быка, а также некоторые подклассовые различия в эффекторных функциях (повышенная способность к фиксации комплемента у IgG1 и к опсонизации – у IgG2) могут быть связаны с высокой степенью жесткости и стерической недоступности шарнирной области IgG2 по сравнению с IgG1 [39, 74].

      Обобщенные  данные по свойствам подклассов иммуноглобулинов G быка [29, 30, 11, 31, 32, 33, 34]                                                               Таблица 1

      1.2. Методы выделения и очистки IgG быка 

      Основными источниками IgG быка (как и иммуноглобулинов быка других классов), как правило, служат сыворотка крови (Serum) и молозиво (Colostrum).

      Большинство методик выделения IgG КРС можно свести к единой схеме, основными стадиями которой являются:

1. выделение «грубой» фракции иммуноглобулинов методом высаливания либо осаждением ПЭГ [25, 57] (иногда для очистки иммуноглобулинов от примесных белков используются риванол или каприловая кислота [76]);
2. выделение требуемого подкласса IgG и очистка от контаминирующих белков с помощью ионообменной, аффинной, иммуноаффинной хроматографии;
3. выделение 7S-фракции мономеров IgG с помощью эксклюзионной, гидрофобной, аффинной хроматографии, или нехроматографически;

      Необходимо  отметить, что в зависимости от целей и задач каждого конкретного  эксперимента в данный перечень могут  быть введены дополнительные стадии, некоторые стадии могут опускаться или заменяться более приемлемыми. Рассмотрим методы, лежащие в основе приведенной схемы, подробнее.

1.2.1. Нехроматографические методы

      Распределение гидрофильных и гидрофобных остатков на поверхности белковой молекулы является признаком, определяющим растворимость  белка в различных растворителях. Гидрофобным группам на поверхности молекул наряду с заряженными и другими полярными группами принадлежит важная роль в определении поведения белков в том или ином растворителе. Для изменения растворимости белка можно манипулировать свойствами воды как растворителя, изменяя ионную силу, pH, количество добавляемых, смешивающихся с водой, органических растворителей и других инертных веществ или полимеров, а также комбинируя эти изменения с изменениями температуры. Чаще всего для селективного осаждения белков используют нейтральные соли [4, 25].

Осаждение белков низкими концентрациями солей.

       Растворимость можно рассматривать как результат  полярного взаимодействия растворенного  вещества с водным растворителем  и ионных взаимодействий его с  присутствующими солями, а также  как результат электростатических сил отталкивания между одноименно заряженными молекулами или небольшими (растворимыми) агрегатами молекул. Некоторые  белки образуют осадок при ионной силе от нуля до физиологического значения (0,15 – 0,2М) вследствие того, что силы отталкивания между молекулами недостаточны. Если поверхность глобулы характеризуется высокой гидрофобностью, то это значит, что лишь малая ее часть взаимодействует с растворителем и соответственно меньшее число заряженных групп реагирует с солями. Если заряд снижается до нуля, электростатическое отталкивание уменьшается и по мере приближения к изоэлектрической точке молекулы притягиваются друг к другу. Этот процесс называется изоэлектрическим осаждением: растворимость белка типа глобулина минимальна при значении рН, близком к его изоэлектрической точке, которая может быть достаточно низка, чтобы привести к осаждению белка.

       Растворимость белков типа глобулинов уменьшается  по мере снижения концентрации соли. Это  свойство может быть использовано на этапах очистки, когда обессоливание  проводят посредством диализа или  гель-фильтрации. Изоэлектрическое осаждение белков с низкой растворимостью можно усилить введением в раствор вещества, снижающего растворимость белка (органические растворители, ПЭГ).

       Следует отметить, что область «всаливания» может быть использована в процессе очистки двумя способами. Во-первых, агрегация может происходить при разведении и диализе, и, если нужный белок присутствует в агрегате, очистка будет эффективной. Во-вторых, можно применять изолектрическое осаждение, используя изменение растворимости в зависимости от рН при постоянной ионной силе. В любой из этих двух ситуаций степень достигнутой очистки обычно оказывается минимальной, если нужный белок остается в растворе, так как при этом в осадок выпадает чаще всего лишь относительно незначительная часть всего белка [25].

Осаждение белков при высокой концентрации соли.

      Белки типа глобулинов обычно характеризуются  также относительно низкой растворимостью и при высокой концентрации соли, хотя из этого правила есть много  исключений. Так, сывороточные γ-глобулины, нерастворимые при низкой концентрации соли, осаждаются сульфатом аммония при относительно низкой концентрации – около 1,5 М. С другой стороны некоторые другие сывороточные глобулины (α и β) обладают более высокой растворимостью в сульфате аммония и осаждаются при концентрации около 2,5 – 3,0 М. Процесс высаливания в основном зависит от гидрофобности белка, тогда как «всаливание» в большей степени определяется распределением зарядов на поверхности глобулы и полярным взаимодействием ее с растворителем.

      Наиболее  часто для осаждения используют сульфат аммония, поскольку он обладает рядом преимуществ, таких как: доступность, бактериостатический эффект, снижение ферментативной активности (используется как стабилизатор белковых растворов), сульфатные осадки можно хранить  много лет [1, 25, 50, 52].

       Помимо  традиционных методов выделения  «грубой» иммуноглобулиновой фракции  высаливанием, осаждением ПЭГ или  этанолом, в последнее время предложены оригинальные методы.

      Semotan K. и Kalab D. в 1997 г. выделяли иммуноглобулиновую фракцию молозива избирательным осаждением всех остальных белков 1%-ным бромидом диметиллаурилбензиламмония при кратковременном нагревании раствора до 37 – 40 ºС, при концентрации иммуноглобулинов в молозиве 3 – 6% и pH = 7,9 – 8,1 [72].

      Xu Y. и Ding Z. в 2004 г. получали БСА и IgG быка с чистотой 98% и 96,8% и выходом по общему белку 2,18% и 0,54% соответственно, используя избирательную денатурацию теплым изопропиловым спиртом всех белков плазмы, кроме БСА и IgG, с последующим разделением их катионообменной хроматографией на CM-Trisacryl [81].

Осаждение белков органическими полимерами.

      Полиэтиленгликоль является органическим полимером. Растворы полиэтиленгликоля различной степени  полимеризации при концентрации до 25% (вес/объем) имеют небольшую вязкость и могут эффективно осаждать компоненты плазмы. Так, осаждение глобулинов происходит при концентрации 10–15%, рН около 8 (можно от 8 до 10) и комнатной температуре. Оптимальная концентрация белка 10–25 мг/мл. При высоких концентрациях осаждающего реагента может возникать эффект соосаждения. Пары полиэтиленгликоля токсичны.

      Наиболее  эффективным является ПЭГ с молекулярной массой 4000 и выше; для осаждения  белков используют ПЭГ с молекулярной массой 6000 и 20000. ПЭГ успешно применяется  для осаждения иммуноглобулинов, которые обладают низкой растворимостью.

      ПЭГ труднее удаляется из белковой фракции, чем соль или органический растворитель. Тем не менее, остаточные низкие концентрации ПЭГ не мешают проведению многих процедур – высаливанию, ионообменной и аффинной хроматографии, гель-фильтрации. Преципитация ПЭГ используется, если плазма или  сыворотка несколько гемолизованы (для хроматографии не более 5% в  образце) [12, 23, 24, 32, 33, 58].

       1.2.2. Хроматографические методы 

      Ионообменная  хроматография – хорошо зарекомендовавший  себя метод очистки белков с хорошей  производительностью и сохранением  ферментативной активности. Этот метод  никак не зависит от скорости диффузии, как эксклюзионная хроматография, разрешение может увеличиваться  при изменении градиента элюции без снижения скорости. Различие в  зарядах позволяет эффективно использовать ионообменную хроматографию. В качестве сорбентов используют анионобменники (DEAE-cellulose) и катионобменники (CM-cellulose). Наибольшее распространение получило фракционирование на DEAE-целлюлозе, так  как она обладает высокой емкостью, позволяющей в небольшом объеме производить фракционирование значительных количеств белков. При подборе  рН буфера руководствуются следующими соображениями: величина рН должна быть на единицу ниже для катионита и на единицу выше для анионита величины изоэлектрической точки белка. Потери белка в случае использования ионообменной хроматографии составляют порядка 20-30% [1, 6, 9, 13, 23, 24, 32, 34, 47, 53, 56].