Модификация иммуноглобулина G быка, специфичного к вирусу инфекционного ринотрахеита, и исследование физико-химических параметров получе

      Но  не все молекулы могут быть разделены  с помощью ионообменной хроматографии. Существуют молекулы сходные по заряду, однако сильно отличающиеся по размеру, и, следовательно, по молекулярной массе. Эти молекулы можно легко разделить гель-фильтрацией. Параметры для эксклюзионной хроматографии таковы: инертная, гидрофильная матрица, малые объемы образца, сравнительно низкие скорости элюции, т.к. разделение зависит от диффузии. Разделение происходит только в одном объеме колонки. Фракционирование белков методом гель-фильтрации используется крайне редко, очевидно, ввиду низкой эффективности процесса. Однако в тех случаях, когда число компонентов белковой смеси заведомо невелико, такое фракционирование может оказаться вполне эффективным приемом. Эксклюзионная хроматография широко используется для определения молекулярных масс белков в нативном состоянии. Для освобождения от фрагментов, олигомеров, а также примесных белков применяются сорбенты на основе дектрана. В основном для этих целей используется сорбент Sephadex G-150 и G-200 [6, 9, 11, 13, 24, 25, 34, 54, 65, 66].

      1.3. Методы тестирования чистоты образцов

      Обычно белковый состав анализируется на гомогенность с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в диссоциирующих и восстанавливающих условиях. Критерии электрофоретической гомогенности заключаются в следующем:

      1. При наложении электрического  поля движущиеся белки образуют  единую зону;

      2. В условиях, когда конвекция и  аномальные влияния исключены,  граница расширяется на не более чем это может быть вызвано диффузией [26]. При диск-электрофорезе и изоэлектрофокусировании должна обнаруживаться единственная белковая полоса, проявляющая характерную для данного белка активность. При электрофорезе в ПААГ в присутствии анионного детергента должна обнаруживаться одна полоса, отвечающая денатурированному белку. При различных методах жидкостной хроматографии критерием гомогенности является обнаружение единственного белкового пика, достаточно симметричного и совпадающего с пиком, характерным для данного белка [3, 15, 25].

1.4. Химическая модификация и ее влияние на физико-химические и биологические свойства белков

      Одним из вопросов, вызывающих интерес в  химии, как свободных, так и связанных  белков, является сохранение функции  белка и как оно соотносится  с изменениями в его структуре. Это становится наиболее важным, когда  дело касается влияния различных  способов инкапсулирования и иммобилизации  на структуру и/или функцию белка [22].

     В течение нескольких десятилетий  белки иммобилизовали, используя  различные типы материалов и технических  приемов, чтобы повысить их стабильность и, как следствие, их коммерческое использование. Одним из способов химической модификации  белков, позволяющих получать водорастворимые  ферментативные препараты медицинского назначения, является реакция между  функциональными группами белка  и водорастворимого полимера, приводящая к образованию водорастворимого конъюгата белка с полимером [21].

     Химическая  модификация является инструментом для улучшения функциональных свойств  белка через изменение его  структуры [46]. К числу задач, решаемых с помощью подобной модификации белков, относятся повышение химической и структурной стабильности белка при его хранении и при введении в организм, пролонгирование действия, устранение или уменьшение нежелательных побочных эффектов (неспецифической токсичности, антигенности и др.) [67].

      В белке для взаимодействия с полимером-носителем  используют главным образом аминогруппы, чаще всего остатков лизина [22]. Участие  в реакции тиольных групп не всегда желательно, так как их в белках немного, и они часто существенны  для физиологической активности. Карбоксильные и ароматические  группы белка используют редко, так  как в первом случае приходится активировать белок, после чего возникает возможность  его сшивания, а во втором – нередко  наблюдается снижение физиологической  активности белка из-за изменения  структуры его гидрофобных областей.

      1.4.1. Модифицирующие агенты и методы конъюгации.

     К настоящему времени описано большое  количество способов мягкой фиксации белков на макромолекуле полимера, затрагивающих различные функциональные группы белка [65]. В связи с этим необходимо рассмотреть наиболее используемые полимеры и методы их активации в реакциях химической модификации белков.

     Обычно  в качестве модифицирующего агента используют полимеры, содержащие функциональные группы (ангидридные, азидные, диазо, гидроксильные, карбоксильные, амино и др.), способные  реагировать с молекулой физиологически активного вещества (белка) [66]. Это одно из основных требований к полимерам, но не единственное. К наиболее важным из них относятся следующие [5]:

  1. Полимер должен растворяться  в воде. Растворимость создается  определенным гидрофильно-липофильным  балансом между присутствующими  в полимере полярными группами  и гидрофобными участками.

  2. Молекулярная масса и молекулярно-массовое  распределение полимера-носителя  должно обеспечить достаточно  длительную циркуляцию физиологического  активного полимера в кровяном  русле. Оптимальная молекулярная  масса в большинстве случаев  находится в пределах 20000 – 80000; для небиодеструктирующихся полимеров-носителей  ее приходится ограничивать 30000.

  3. Полимер-носитель должен быть  биосовместимым, то есть не взаимодействовать с кровью, не вызывать токсических эффектов.

  4. Полимер-носитель должен быть  коммерчески доступен.

     В настоящее время данным требованиям  удовлетворяет большое число  синтетических полимеров, таких  как карбоцепные полимеры, характеризующиеся простотой синтеза и большой возможностью варьирования структуры [5]. Наиболее известным представителем карбоцепных полимеров, имеющих поли-N-виниламидное строение, является поливинилпирролидон, обладающий биологической совместимостью и весьма низкой токсичностью [6]. Из гетероцепных полимеров-носителей наиболее популярны декстран и полиэтиленгликоль [60, 61]. Также применяют полиакриловую кислоту, полиакриламид и многие другие [67].

Модификация белков поливинилпирролидоном.

     ПВП хорошо растворим в воде в широком  интервале концентраций. Амидные  группы в его боковой цепи устойчивы  к тепловой обработке в водном растворе до 110 – 130°С. Слабые кислоты и щелочи не вызывают химических превращений пирролидонового кольца на цепи в отличие от низкомолекулярного аналога N-метилпирролидона. Макромолекулы ПВП в водном растворе обладают высокой комплексообразующей способностью к молекулам самого различного строения [6]. Кроме того растворы этого полимера характеризуются выраженной вязкостью, что обусловлено образованием в водных растворах межмолекулярных ассоциатов молекул полимера различного диаметра, причем вязкость этих растворов заметно возрастает с увеличением их концентрации [68]. ПВП характеризуется низкой токсичностью и биологической совместимостью.

     Для получения конъюгатов ПВП-белок  используют метод активированных эфиров. Предварительно проводят активацию карбоксильных групп полимера в щелочной среде при нагревании. Образующиеся активированные эфиры – устойчивая форма производных карбоновых кислот. Эфирный компонент этих соединений содержит электронно-акцепторные группы, и поэтому такие эфиры легче подвергаются аминолизу, чем, например, алкиловые эфиры

     Активированные  эфиры селективно реагируют с  аминогруппами. Данный метод – наиболее мягкий и селективный, но сложный  способ получения химерных физиологически активных полимеров. Так при модификации  с помощью ПВП трипсина и химотрипсина экранируется более 2/3 свободных аминогрупп. Этим же методом были модифицированы каликреин и b-D-ацетилгексозаминидаза-А.

     Более простой путь получения конъюгатов заключается в использовании  сополимеров винилпирролидона с  другими функциональными мономерами.

Модификация белков сополимерами поливинилпирролидона

     При модификации сополимерами винилпирролидона с кротоновой и акриловой кислотами  используют карбодиимидный метод. Это достаточно мягкий метод. При активации сополимера он приводит к образованию амидных или сложноэфирных связей.

     Его селективность зависит от реакционной  среды и температуры. Присоединение  карбоксилсодержащих соединений к  аминогруппам белка обычно осуществляется с избытком карбоксильных групп  и эквивалентным количеством  водорастворимого карбодиимида при  рН=5 и комнатной температуре [69]. В водных и вводно-органических средах при низких температурах аминогруппы реагируют значительно быстрее, чем гидроксильные, которые в этом случае не требуют временной защиты.

     Основная  побочная реакция – образование  N-ацилмочевин, которые остаются связанными с полимером, если к нему была присоединена исходная карбоксильная группа [67].

     При модификации сополимерами используют различные соотношения мономерных звеньев. Например, в работе по модификации  стрептокиназы использовали «Совиаль»  – сополимер N-винилпирролидона и диацеталя акролеина, содержащий около 10 моль% остатков акролеина [70]. При модификации террилитина использовали сополимер, содержащий до 20 моль% остатков акролеина [71]. В некоторых случаях необходимо строго соблюдать соотношение мономеров в полимере, так как это отражается не только на физико-химических свойствах, но и на биологических. Так в сополимере винилпирролидона с акриловой кислотой доля акриловых мономеров должна быть значительно меньше, так как они придают токсичность полимеру [9].

     При использовании в качестве модификатора сополимера винилпирролидона с акролеином в качестве способа модификации  применяют альдегидный метод [5]. При связывании альдегидсодержащего полимера с белком происходит образование азометиновой (альдиминовой) связи или так называемых оснований Шиффа [-CH=N-] между карбонильной группой полимера и ε-аминогруппой лизина белковой молекулы^

     Данная  связь лабильна, так как является стабильной в водной растворе несколько  суток [6], а потом гидролизуется при физиологическом значении рН и ионной силы без участия ферментов [5]. Она может быть стабилизирована сопряжением с двойной связью или хелатообразованием, а также превращена восстановлением в очень прочную аминную связь. В последнем случае в качестве восстанавливающего агента используют чаще всего боргидрид натрия [72]:

      1.4.2. Влияние модификации  на структуру и  свойства белка.

      Можно полагать, что некоторые новые  свойства, приобретаемые белком после  его модификации, возникают не только как прямое следствие образования  в белковой глобуле ковалентных  связей и экранирующей полимерной оболочки [22]. Действительно, если процессы (желательные  и нежелательные) с учетом белковой глобулы в свободном и модифицированном состоянии и других соединений, находящиеся  в окружающей среде, проходят через  стадию их предварительной взаимной пространственной подстройки, то неспецифическое  экранирование в равной степени  будет затруднять обе группы процессов. С другой стороны, можно предположить, что образование в белке внутримолекулярных ковалентных связей, дополненной  нековалентными взаимодействиями комплементарных  групп белка и полимера-модификатора, будет приводить не только к стабилизации белковой структуры [22, 30] при действии денатурирующих факторов, но и влиять также на ее способность к подстройке при межмолекулярных взаимодействиях. Подобные явления, например, наблюдаются при образовании межмолекулярных связей, когда уменьшение подвижности взаимодействующих групп полимерных цепей влияет на структуру межмакромолекулярного соединения (конъюгата). Следствием этого может оказаться увеличение избирательности белка при выборе комплементарного партнера в процессе функционирования [21].

      Для того чтобы судить о молекулярных механизмах изменения свойств белков при их модификации водорастворимыми полифункциональными реагентами, целесообразно  сопоставить структурно-динамические свойства белковых макромолекул в свободном  и модифицированном состояниях, а  также изменения этих свойств  при действии денатурирующих факторов и в процессе специфической активности [30]. Например, химическое конъюгирование гиалуронидазы с декстраном усиливало  гидрофобное взаимодействие и стерические  препятствия в глобуле белка. Указанное укрепление структуры уменьшало ингибирующее действие гепарина пропорционально росту степени модификации поверхностных групп аминогрупп фермента. Выдвинуто предположение о возможности использования модифицированной гиалуронидазы для терапии острых сердечно-сосудистых поражений [17].