Культивирование и хранение микроорганизмов

     Для реактивации к лифилизированным клеткам добавляют по каплям стерильную или водопроводную воду в количестве 0,5-1,0 мл. после регидратации клетки высевают на богатые питательные  среды.

     Лиофилизацию  широко применяют для длительного  хранения различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживаемость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Pichia и Hansenula выдерживают лифилизацию лучше, чем слабоспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodotorula.

      Хранение при низких и сверхнизких температурах. Хранение микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.

       Клетки замораживают при разных температурах (от -10 до -196⁰) и различных скоростях замораживания. Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспендируют в растворах криопротекторов. Чаще других применяют 10-20%-ный раствор глицерина, 7-10%-ный раствор диметилсульфоксида или 20%-ный раствор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (10⁹-10¹⁰ клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчивающейся крышкой. Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой -70⁰, а затем переносят в жидкий азот, где и сохраняют при -196⁰. оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на 2 мин в водяную баню с температурой 35-45⁰. клетки из ампул высеиваются на богатые питательные среды.

     При температуре хранения от -20 до -40⁰ хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при -70⁰ в твердой углекислте и особенно в условиях сверхнизких температур: при -196⁰ (жидкий азот) или при -210⁰ (газовая фаза жидкого азота).

     Хранение  в глицероле. Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких температурах (-20⁰) в растворах глицерола, который служит криопротектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости их. Наибольшее распространение это способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор.

     Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-ный раствор глицерола  в дистиллированной воде и стерилизуют  его при 1 ати в течение 30 мин. Клетки из выросшей культуры (обычно из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные  для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеролом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендрофа, а для их приготовления использовать автоматические пипетки со стерильными наконечниками и готовить смеси в ламинарном шкафу. Из сохраняемых клеток периодически (2-6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консерваций той или иной культуры и периодичности их пересева.

     Для хранения микроорганизмов с твердых сред перед смешиванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оптимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспериментально). Можно также суспендировать клетки с твердых сред непосредственно в 25%-ном стерильном глицероле.

     Хранение  в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде или 1%-ном раствре хлорида натрия не требует специального оборудования и доступно любому экспериментатору. Допустимые сроки хранения некоторых микроорганизмов этими методами приведены в таблице 3.

     Микроорганизмы  предварительно выращивают в оптимальных  условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной воде или 1%-ном  растворе хлорида натрия. Успешному  сохранению клеток способствует высокая плотность суспензии – не менее 10⁸-10⁹ клеток в 1 мл. Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Оставлять на хранение рекомендуется клетки начала стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы – споры, цисты.

     Хранение  в высушенном состоянии  на адсорбентах. Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель, вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники это способ не имеет. В самом общем виде он сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории.

     Оценка  жизнеспособности микроорганизмов  после длительного  хранения. Жизнеспособность микроорганизмов после различных сроков хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100%.