Культивирование и хранение микроорганизмов

     Федеральное агентство по образованию

     Государственное образовательное  учреждение

     Высшего профессионального  образования

     Уральский государственный  педагогический университет

     Географо-биологический  факультет 
 
 
 
 

Доклад 

на тему:

«КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ» 
 
 
 
 
 
 
 
 

Исполнители: Лукина Наталия

Студ. ГБФ, 501 гр.

Преподаватель: Сулейманова Надежда

Александровна 
 
 
 
 

Екатеринбург

2010 г. 
 

ВВЕДЕНИЕ

     Культивирование организмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биологических особенностей микроорганизмов и понимания значения физико-химических условий среды, необходимых для жизнедеятельности. 

     ПРИНЦИПЫ  СОСТАВЛЕНИЯ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ  МИКРООРГАНИЗМОВ

     В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах, поэтому питательная среда должна содержать все вещества, необходимые  для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимы для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

     Основными компонентами любой питательной  среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

     По  потребностям в углероде микроорганизмы принято делить на две группы –  автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислоту – соединение, содержащее углерод в наиболее окисленной форме. В соответствии с этим при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация углекислоты в воздухе не превышает 0,03% и ее поступление в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. Поэтому в среды для культивирования автотрофов вносят бикарбонат натрия (NaHCO₃) или карбонаты, чаще всего углекислый кальций (CaCO₃). В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащенный 1-5% углекислоты.

     Потребности гетеротрофных микроорганизмов  не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для их развития среда  должна содержать органические соединения. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения углерода – кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения.

     Вторым  основным компонентом питательной среды является источник азота. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановительной форме – в виде амино (-NH₂-) и имино (NH-)-группы. Тем не менее потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотосодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть соли аммония. В этом случае в среды вносят NH₄Cl или (NH₄)₂SO₄. Следует, однако, помнить, что аммонийные соли – физиологически кислые соли, так как по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты, что приводит к заметному возрастанию и кислотности и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов.

     Питательные среды для культивирования некоторых микроорганизмов должны включать одну, несколько или полный набор аминокислот. Отдельные аминокислоты в L- и D-форме добавляют к стерильной среде в концентрации от 0,1 до 0,05 г га 100 мл непосредственно перед засевом ее микроорганизмами. Для этого рекомендуют использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан – в дистиллированной воде, подщелоченной NaOH, остальные аминокислоты – в дистиллированной воде, подкисленной HCl. Аминокислоты – цистин и цистени, а также амиды – глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 ати в течение 15 мин.

     Потребности микроорганизмов в некоторых  аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатин, казеин) или растительные (семена сои, подсолнечника) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с помощью протеолитических ферментов или кипячением с минеральными кислотами либо с крепкими щелочами. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения.

     Наиболее  требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного  расщепления – пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных оснований, солее и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (белок соевой муки) происхождения. В питательные среды пептон добавляют от 1-2 до 20 г на 1 л.

     Необходимо  иметь в виду, что аминокислоты и пептон микроорганизмы могут использовать не только как источник азота, но и  как источник углерода и энергии.

     Некоторые бактерии способны использовать в качестве единственного источника азота молекулярный азот N₂. Это азотофиксаторы. В среде для культивирования таких микроорганизмов соединений азота можно не вносить. Снабжение азотофиксаторов газообразным азотом осуществляется благодаря соприкосновению среды с воздухом или культивированию в атмосфере азота.

     Многие  микроорганизмы требуют наличия  в среде так называемых факторов рост, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термин прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вносить их в культуральные среды, используя  следующие концентрации: тиамин (витамин В1), пантотенат Са, рибофлавин (витамин В2), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин В12) – по 1 мкм на 1 мл среды; фолиевая кислота и n-аминобензойная кислота 0 по 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин – 0,005 мкг на 1 мл среды.

     Витамины  добавляют к стерильной среде  непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация витамина превышает его содержание в питательной среде в 100 раз. Растворы готовят в стерильной посуде и используют стерильную дистиллированную воду. Исключение составляют рибофлавин и фолиевая кислота.

     Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могу служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрожжевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат – в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5-30 мг на 100 мл среды. Кукурузный экстракт – готовый продукт заводов крахмалопаточной промышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, небольшое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среду от 0,2 до 5%; стерилизуют при 0,5 ати.

     Кроме источников углерода, азота и факторов роста микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы сера, фосфор и ряд других элементов. Все они  должны содержаться в среде в  доступной форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Поэтому «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу.

     Соли  фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы – K, Na, Ca, Mg, Fe, Mn, Co, Cu – и другие элементы  микроорганизмы получают в форме катионов и анионов неорганических.

     Питательные среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетический материал. По способу получения энергии все микроорганизмы делят на две основные группу: хемотрофы и фототрофы.

     Хемотрофы используют энергию окисления различных  соединений. В зависимости от окисляемого субстрата (донора водорода) среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Первые окисляют неорганические  соединения, такие как H₂S, S⁰ или другие не вполне окисленные соединения серы, H₂, NH₄⁺,NO₄^- или Fe₂⁺.

     Для хемоорганотрофов энергетическим субстратом служат органические вещества, которые  играют двоякую роль, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии. Однако есть микроорганизмы, которые для конструктивных и  энергетических процессов нуждаются в разных соединения.

     Фототрофы используют энергию света. Чтобы  удовлетворить потребности этих бактерий в энергии, их культивируют при естественном или искусственном  освещении.

     По  составу принято выделять естественные, или натуральные, среду и синтетические среды.

     Натуральными  называют среды, в состав которых  входят продукты животного или растительного  происхождения. К таким средам можно  отнести овощные и фруктовые  соки, животные ткани, разведенная кровь, вода морей, озер, и минеральные источников, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов, таких как мясо, почва, навоз, различные части растений, клетки микроорганизмов.

     На  натуральных средах хорошо растут многие микроорганизмы, поскольку такие  среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясопептонный бульон, нехмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

•   Мясопептонный бульон (МПБ). Основой для его приготовления служит мясная вода, которую готовят следующим образом: 500 г мяса, освобожденного от костей, жира и сухожилий, мелко нарезают или пропускают через мясорубку, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют при комнатной температуре на 12 ч или в термостате при 30⁰ на 6 ч, а при 37⁰ – на 2 ч. За это время и мяса экстрагируют различные вещества, в том числе водорастворимые витамины. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и добавляют 1% пептона и 0,5% NaCl. МПБ – богатая питательная среда, но она почти не содержит углеводов. В случае необходимости их добавляют к МПБ чаще всего в количестве 1-2 г на 100мл. МПБ стерилизуют при 1 ати.
• Солодовое (неохмеленное пивное) сусло – хорошая среда для некоторых молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов и других представителей гетеротрофных микроорганизмов. Основные компоненты сусла – углеводы (90% от общей массы сухого остатка) и азотосодержащие соединения (до 6-7% от общей массы сухого остатка). Из углеводов в наибольшем количестве содержатся мальтоза и декстрины. В состав сусла входят витамины, преимущественно группы В, органические кислоты и минеральные соли.