Культивирование и хранение микроорганизмов

     В случае необходимости рН сред доводят  до нужного значения растворами кислот, щелочей или солей, имеющих щелочную реакцию. Для корректировки рН целесообразно иметь растворы разной концентрации. Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и довести до нужного, если этого требуется, стерильными растворами кислот или щелочей.

     Чтобы не допустить чрезмерного изменения  рН в культурах микроорганизмов  и удержать его на необходимом  уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы.

     Поддержание определенного значения рН во время  роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые образуют в процессе жизнедеятельности кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады. Большие затруднения встречаются, когда нужно поддерживать рН в слабощелочных средах, так как для диапазона рН от 7,2 до 8,5 подходящих буферов не существует. Поэтому иногда приходится периодически или непрерывно доводить рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислот или щелочей при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств.

2. АЭРАЦИЯ

     Кислород  входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя. Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут при парциальном давлении О₂ меньшем, чем в воздухе. Получение энергии у этих микроорганизмов не связано с использованием молекулярного кислорода. Для многих из них кислород токсичен – он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называют облигатными анаэробами. Среди микроорганизмов выделяют также группу факультативных анаэробов, представители которой способны расти как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода. Например, некоторые дрожжи или энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осуществляют аэробное дыхание или брожение.

     Неодинаковые  потребности микроорганизмов в  свободном кислороде определяют различия и в способах их культивирования.

     КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

     Культивирование на поверхности плотных  и жидких средах. В этом случае микроорганизмы выращивают на поверхности плотной среды или в тонком слое жидкой среды, и кислород поступает к ним непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном – чашки Петри, колбы Виноградского, матрицы (см. рис. 2). В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

     Глубинное культивирование  в жидких средах. Все способы глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать. При аэрировании среды учитывают два показателя: интенсивность аэрации и степень растворения. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кислорода в единице объема культуральной среды за единицу времени. Степень аэрации – это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.

     Наиболее  простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок со скоростью 100-200 и более оборотов в минуту. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно уменьшением объема среды или применением колб с отбойниками – вдавливаниями внутрь в виде 4-8 отростков 2-3 см длинной (см. рис.2). При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников, тем сильнее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация.

     Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов  на качалках характеризуется, как правило, скоростью поглощения кислорода водным раствором сульфита. Сульфитный метод не дает возможности определить концентрацию кислорода в культуре. Концентрацию кислорода, растворенного в культуральной жидкости, определяют полярографически.

       Помимо перемешивания аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ часто используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении продуктов жизнедеятельности микроорганизмов – антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость протекания воздуха через среду необходимо контролировать. Для этого используют различные приборы: газовые часы, ратометры и др. В ферментерах количество пропускаемого воздуха поддерживают на заданном уровне автоматически. Воздух стерилизуют путем прохождения через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных опытах, когда объем и скорость поступления воздуха невелика, используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для возможно более сильного распыления воздух пропускают через мелкопористые пластинки – барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные фильтры.

     Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, используют обычный воздух. Продувание сред кислородом в лабораторных условиях не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до 40 мг/л) может привести к угнетению роста микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механическим перемешиванием среды мешалками, скорость вращения которых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту. Схема ферментрера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов приведена на рис. 3.

     КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

     Выращивание анаэробных микроорганизмов более  сложно, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют разные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.

     Выращивание в высоком слое среды. Это наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Так как нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ее сосуд для культивирования сразу же после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане 30-40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

     Культивирование в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в вязких средах,  таких как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудитель маслянокислого или ацетонобутилового брожения. Вязкость жидких сред легко увеличить, если добавить к ним 0,2-0,3% агара.

     Выращивание в толще плотной среды. Этим приемом пользуются для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении численности анаэробных микроорганизмов. Посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48-50⁰ агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бури или чашки Петри. Поверхность среды в пробирках заливают парафином. Трубки Бури – это стеклянные трубки длиной 20-25 см, диаметром 1,0-1,5 см. трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой (рис.4).

     При использовании чашки Петри для  выращивания анаэробов засеянную  агаризованную среду наливают в  крышку чашки и, после того как  среда застынет, плотно прижимают  к ее поверхности дно чашки. Зазор  между стенками дна и крышки, где  среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (рис.5). 

        Выращивание в анаэростатах. Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах – вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90-80%) и углекислоты (10-20%), до давления порядка 67*10³ Па (500 мм рт.ст.). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха. 

     Некоторые строгие анаэробы, например, метанобразующие  бактерии, ацетогены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу, микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при кратковременном контакте с кислородом воздуха. Работа с такими микроорганизмами представляет  большие трудности и требует специального оборудования. Для культивирования строгих (облигатных, экстремальных) анаэробов необходимо применять методы, позволяющие исключать молекулярный кислород из сред культивирования, создать и поддерживать в них низкий окислительно-восстановительный потенциал (ОВП). С этой целью использую технику, разработанную профессором Хангейтом:

1. среды для выращивания микроорганизмов и все добавки в них готовят перед автоклавированием с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (кипячением и т.д.);
2. после автоклавирования среды и добавки для них немедленно охлаждают в токе стерильного газа, освобожденного от следов кислорода пропусканием над медными стружками, нагретыми до 350-400⁰С;
3. до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кислорода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки;
4. посевы, разлив сред, в том числе агаризованных, проводят в токе стерильного газа, не содержащего кислорода;
5. микроорганизмы выращивают и поддерживают в герметически закрытых сосудах, в атмосфере бескислородного газа, часто под давлением для исключения проникновения воздуха;
6. все шланги, по которым идут газы для продувки сосудов, должны быть из специальной резины, со слабой степенью диффузии кислорода воздуха, или заменены на металлические трубки;
7. все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содержащих кислорода.

     Степень поглощения кислорода и восстановленности  среды определяется окислительно-восстановительным  потенциалом Eh, который может быть измерен электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторных красителей, например, резазурина, феносафранина, нейтрального красного и т.д., изменяющих окраску при изменении Eh. Особенно удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 0,0001% и стерилизуют вместе с минеральными компонентами среды. В окислительной форме он окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Резазурин изменяет окраску при значениях ОВП, близких к -420 мВ, феносафранин – в области -252 мВ.

       Для культивирования анаэробов предложены специальные камеры и система ГазПак, образующая газы (водород и СО₂) в замкнутом пространстве и эффективно поглощающая кислород. В качестве поглотителя кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионита натрия, металлическое железо и некоторые другие реактивы. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия.