Культивирование и хранение микроорганизмов

Сусло готовят следующим образом: 250 г  размолотого солода заливают 1 л  водопроводной воды, нагревают до 48-50⁰ и поддерживают эту температуру в течение получаса, непрерывно помешивая смесь, чтобы избежать образования комков. В последующие полчаса температуру поднимают до 55-58⁰ и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала, т.е. до тех пор, пока реакция остывшей смеси с йодом будет отрицательной. При указанном режиме происходит также гидролиз белков до аминокислот и пептидов. Полученный экстракт фильтруют через бумажную пульпу или вату. В фильтрате определяют концентрацию сахара, пользуясь ареометром Баллинга, градусы (Б⁰) которого примерно соответствуют процентному содержанию сахара в сусле. До нужной крепости сусло доводят водопроводной водой. Для культивирования микроскопических грибов чаще всего используют 3-4⁰ Б сусло, для дрожжей – 6-8⁰ Б, а для наиболее требовательных молочнокислых бактерий – 8-12⁰ Б сусло. Сусло стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

• Дрожжевая среда используется для культивирования ряда гетеротрофных микроорганизмов. Основа дрожжевой среды – дрожжевая вода. Для ее приготовления 70-100 г свежих  прессованных или 7-10 г сухих дрожжей 30 мин кипятят в 1 л воды, и после осаждения клеток дрожжей жидкость декантируют или фильтруют через вату. К фильтрату добавляют 1 л воды, еще раз 30 мин кипятят и вновь фильтруют. К 100 мл полученной дрожжевой воды добавляют 1-2 г углеводов и минеральные соли, чаще всего K₂HPO₄ (0,1г) и NaCl (0,5г). Доводят рН среды до 6,8-7,2. Среду стерилизуют при 0,5 ати 20-30 мин.
• Картофельная среда используется в основном для культивирования спорообразующих бактерий, представителей рода Caulobacter и некоторых других хемоорганотрофных бактерий. Для приготовления этой среды 200 г тщательно вымытого и очищенного от кожуры и глазков картофеля нарезают мелкими ломтиками, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 20-30 мин. Отвар фильтруют через вату, доводят объем фильтрата до 1 л и разливают в сосуды для культивирования. Среду стерилизуют 1 ч при 1 ати или 30 мин при 1,5 ати.
• Почвенный экстракт используют главным образом для культивирования разнообразных представителей почвенных микроорганизмов. Для его приготовления 500 г плодородной почвы заливают 1,5 л водопроводной воды и автоклавируют при 1 ати 30 мин. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр, добавляют к горячему фильтрату 0,5 г CaCO₃, тщательно перемешивают и через 5-7 мин фильтруют вновь. К экстракту, как правило, добавляют 0,2 г K₂HPO₄.

     Синтетические среды – это среды, в которые  входят лишь соединения определенного  химического состава, взятые в точно  указанных количествах. Синтетические  среды широко используют при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу.

     Наряду  с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые полусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического  состава – углеводы, соли аммония  или нитраты, фосфаты и т.д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

     Следует иметь в виду, что среды, обеспечивающие хорошее развитие микроорганизмов, не всегда подходят для решения других исследовательских и практических задач, так как далеко не во всех случаях накопление какого-либо продукта жизнедеятельности – фермента, витамина, антибиотика и т.д. – идет параллельно накоплению биомассы. Нередко при обильном росте микроорганизмов желаемый продукт метаболизма почти не образуется или образуется в недостаточном количестве. Чтобы обеспечить образование необходимого соединения в максимально возможных количествах, применяют специальные среды.

     По  физическому состоянию различают  жидкие, сыпучие и плотные среды.

     Жидкие  среды широко применяют для накопления биомассы или продуктов обмена, для исследований физиологии и биохимии микроорганизмов, а также для поддержания и сохранения в коллекции культур микроорганизмов.

      Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

     Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекциях и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или желатин. Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают питательной средой.

       АГАР используют для уплотнения сред очень часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Кроме того, агар включает небольшое количество легко ассимилируемых веществ и различные соли. Агар получают из некоторых морских водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100⁰ и затвердевает при температуре 40⁰. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных микроорганизмов.

      Чаще всего  агар добавляют к средам в количестве 1,5%. Если необходимо получить более влажную среду, вносят 1,0%, а более плотную и сухую – 2-3% агара. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предлагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризованной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед подсевом. Для этого пробирки с расплавленной в кипящей водяной бане средой  устанавливают в наклонном положении (рис.1) и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на 4-6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20-20 мл в пробирки большего объема, чем для скошенной агаризованной среды, или стерилизуют в колбах. В последнем случае до стерилизации агар не расплавляют. 
 

     Агар  имеет слабощелочную реакцию, поэтому  его добавление может привести к  незначительному повышению рН среды. В слабокислых, нейтральных или  слабощелочных средах агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких циклов плавления и затвердевать и даже после повторной стерилизации. Однако необходимо помнить, что при рН среды ниже 5,5 агар при стерилизации частично гидролизуется и поэтому теряет способность образовывать гель, т.е. застывает. В этом случае его стерилизуют отдельно от среды в определенном объеме воды, расплавляют на водяной бане и приливают к стерильной, предварительно подогретой среде.

     Агар  содержит примеси органических и  минеральных веществ, которые иногда нежелательны. Чтобы избавиться от большинства из них, поступают следующим образом. Агар заливают водопроводной водой и ставят в термостат на 30-37⁰. примеси вымываются в воду и разлагаются под действием развивающихся в ней микроорганизмов. Через день-два жидкость сливают, агар промывают несколько раз свежей водой, снова заливают водой и вновь ставят в термостат. Когда эта вода помутнеет, то ее опять заменяют новой, и так делают до тех пор, пока не исчезнет запах, а вода не перестанет мутнеть. Обычно через 2-3 недели получают агар, лишенный растворимых органических и минеральных веществ. Воду сливают, агар помещают в двойной марлевый мешок и 2-3 суток промывают проточной водопроводной водой, затем раскладывают его тонким слоем и просушивают на воздухе или в сушильном шкафу при 40-50⁰.

     Эффективно  заменят агар может более дешевый  каррагенан, экстрагируемый из определенных видов красных морских водорослей. Каррагенан не разрушается большинством видов микроорганизмов. Из него можно  готовить гели, устойчивые к температурам до 60⁰. Среды с каррагеннаном готовят, как и среды с агаром. После добавления каррагеннана к основной жидкой среде ее кипятят, чтобы полностью растворить его, а затем стерилизуют автоклавированием. Стерильную среду охлаждают до 55-60⁰, разливают в чашки и дают застыть. Для гелей, устойчивых при 60⁰, добавляют 2,4%каррагенана, при 45⁰ – 2,0%.

     Иногда  для экономии агара используют смесь  с полиакриламидами в соотношении 1:1.

     ЖЕЛАТИНА – это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном – белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25⁰, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30-37⁰). Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатину используют главным образом в диагностических целях – для выявления протеолитических и глубинных колоний дрожжей. В первом случае употребляют мясо-пептонную, во втором – сусловую желатину.

     К жидким средам добавляют 10-12% желатины, оставляют набухать 5-10 мин и нагревают  на водяной бане до растворения. Доводят  рН среды до 6,8-7,0. Желатина имеет  кислую реакцию и обладает большей буферностью, поэтому на ее нейтрализацию идет больше щелочи. Желатиновые среды стерилизуют при 0,5 ати 15 мин или дробно – 3 раза по 20 мин в кипятильнике Коха. Повторная стерилизация желатиновых сред, особенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, поскольку желатина частично гидролизуется и теряет гелеобразующие свойства.

     КРЕМНЕКИСЛЫЙ  ГЕЛЬ (силикагель) используют иногда как  твердую основу для синтетических  сред. Гель готовят следующим образом. К соляной кислоте плотностью 1,1 добавляют при перемешивании равный объем раствора жидкого стекла (Na₂SiO₃ или K2SiO₃)той же плотности. Смесь разливают в чашки Петри по 20-30 мл в каждую и оставляют чашки на горизонтальной поверхности на несколько часов до образования кремнекислого геля. Когда гель станет плотным, открытые чашки помещают в стеклянный или эмалированный сосуд, промывают 2-3 суток проточной водой для удаления хлоридов, а затем несколько раз горячей дистиллированной водой. Об отсутствии хлоридов судят по качественной пробе промывных вод с 1-5%-ным раствором азотнокислого серебра: при наличии хлоридов образуется белый осадок. Отмытые от хлора пластинки пропитывают 2-3 мл концентрированной среды, содержание компонентов в которой в 5-10 раз выше, чем в соответствующей среде. Затем чашки с гелевыми пластинками помещают открытыми в сушильный шкаф и подсушивают при 50-60⁰, следя за тем, чтобы гель не растрескался и его поверхность осталась влажной. Если необходимо, чашки завертывают в бумагу и, не переворачивая, стерилизуют в автоклаве при 0,5 ати 15 мин. Пластинки, предназначенные для выделения и культивирования автотрофных бактерий, можно не стерилизовать. Стерилизуют только среду, которой пропитывают гель. Чашки с силикагелевыми пластинками до употребления сохраняют под водой.

     Некоторые особенности агара, желатины и кремнекислого геля суммированы в таблице 1.

     УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ  МИКРООРГАНИЗМОВ

     Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной  среды, но и такие факторы как  кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

1. АКТИВНАЯ КИСЛОТНОСТЬ СРЕДЫ

     Активная  кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7,0, напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определить значение рН. Изменяют рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использовать различные жидкие и бумажные индикаторы.