Культивирование и хранение микроорганизмов

       Для культивирования строгих  анаэробов предложены специальные камеры, заполненные газовыми смесями (чаще всего 90% N₂, 5% СО₂ и 5% Н₂), которые содержат внутри все необходимое для выполнения микробиологических работ, включая термостат. Это оборудование сложно и дорого, но оно имеет неоспоримое преимущество – контакт клеток с кислородом воздуха остается минимальным на всех этапах работы.

3. ТЕМПЕРАТУРА

     Интервалы температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно  варьируется. У мезофиллов, к которым  относится большинство известных  нам форм, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37⁰. У термофилов он значительно выше – от 45 до 80-90⁰. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5-10⁰. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияет на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая оптимальная температура. Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых являются вода и почва, выращивают в интервале от 20 до 30⁰, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или кишечника человека и животных культивирую при более высокой температуре – 35-37⁰.

     Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

4. СВЕТ

     Для роста подавляющего большинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые солнечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Поэтому такие микроорганизмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естественное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фоторофов выращивают в люминостатах, т.е. в камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необходимая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.

     Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами  волн, при которых осуществляют  фотосинтез культивируемые микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и  зеленых бактерий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования цианобактерий и микроводорослей можно применять флуоресцентные лампы дневного света. Помимо спектрального состава света обращают внимание на освещенность, которую измеряют с помощью люксметра. 

5. ВОДА

     Рост  микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в доступной для клетки форме, т.е. жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворенных веществ и не может быть использована микроорганизмами. Доступность воды в субстрате для роста микроорганизмов выражают величиной активности воды (a_ω):

     где Р – давление пара раствора (мм рт. ст.); Ро – давление пара чистой воды (мм рт. ст.) при данной температуре. Значение a_ω для дистиллированной воды равно 1,00. при растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки воды.

     Микроорганизмы  могут расти на средах со значением  a_ω от 0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и мицелиальных грибов. Так, большинство бактерий, за исключением галлофилов, хорошо растут на средах с величиной a_ω от 0,99 до 0,95, минимальная величина a_ω, обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до 0,88.

       Активность воды в среде можно определить по формуле a_ω=А/100, где А – относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равновесии в закрытом сосуде, содержащем среду. Различную активность воды в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.

6. ПЕРИОДИЧЕСКОЕ И НЕПРЕРЫВНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

       Существуют две принципиально разные системы выращивания микроорганизмов в жидкой среде. В одном случае после инокуляции среды не происходит ни добавление в нее, ни удаление каких-либо компонентов, кроме газовой фазы. Такая закрытая система культивирования носит название периодической и может поддерживать размножение клеток в течение ограниченного времени, на протяжении которого меняется состав исходной среды и окружающие условия.

     Непрерывное (проточное) культивирование в отличии  от периодического характеризуется  постоянной подачей питательной  среды со скоростью, равной скорости удаления культуры. При этом объем  культуры в ферментере во времени  не меняется. Одно из основных непрерывного культивирования – хорошее перемешивание культуры в ферментере. Система непрерывного культивирования может быть реализована по принципу турбидостата или хемостата. Турбидостат – наиболее простой режим проточного культивирования, концентрация клеток в нем выбирается исследователем, а поступление питательных компонентов автоматически реализуются в соответствии с плотностью популяции. Меняя скорость подачи питательной среды («скорость разбавления»), экспериментатор может получать разные значения скорости роста популяции – от близких к нулю до максимальной, таким образом воспроизводя разные состояния культуры от стационарной фазы до стадии экспоненциального роста.

     Для непрерывного культивирования микроорганизмов  может быт использован слегка модифицированный ферментер, применяемый при периодическом культивировании (рис.3). В первом случае требуется система двойного насоса (для добавления свежей среды и удаления культуральной жидкости), используемая вместе с регулятором уровня среды; при этом культуральная жидкость удаляется через отверстия для отбора проб. Такие насосы необходимы при проточном культивировании в больших емкостях. В малых ферментерах удаление жидкости может происходить через боковую отводную трубку, расположенную на уровне, позволяющем поддерживать определенный объем культуры. Малые ферментеры с боковым отводом жидкости можно изготовить из стандартных стеклянных или стальных сосудов. 

     ХРАНЕНИЕ  МИКРООРГАНИЗМОВ

     Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономических, а также любых других, важных для исследователя свойств. Общего метода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и разнообразных групп микроорганизмов, пока не существует. Поэтому в крупных коллекциях разные группы микроорганизмов сохраняются различными методами. Кроме того, чтобы исключить возможность потери микроорганизма, каждый штамм сохраняется не один, а несколькими способами.

     К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические посевы на свежие питательные среды, сохранение культур на питательные среды под вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

     Периодические посевы на питательные  среды. Этот способ был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхности скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы – в полужидкую среду, содержащую 0,2-0,3% агара, анаэробы – в толщу плотной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки микроорганизмы используют для работы, культуру во второй пробирке оставляют для сохранения и последующего пересева.

     Частота пересева на свежую среду  различных  микроорганизмов неодинакова и  в большей степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать раз в 1-2 месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бактерии, которые нуждаются в более частых пересевах. Допустимые сроки пересевов некоторых микроорганизмов приведены ниже. Хранение культур в холодильнике при 4-6⁰ позволяет увеличить время между пересевами.

     Поддержание культур микроорганизмов регулярными  пересевами имеет ряд существенных недостатков. Основным из них – возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.

     Хранение  под минеральным маслом. Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Это метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности таксономических групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами.

     Микроорганизмы  выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде; аэробные микроорганизмы – на поверхности коротко скошенной (под углом 450) среды, анаэробы – в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием).  После того как культуры хорошо разовьются, их заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают через 2-7 суток после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актинонимицеты – в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4-10 суток, мицелиальные грибы – через 7-12 суток.

     Наиболее  пригодно для заливки культур  микроорганизмов высокоочищенное  медицинское вазелиновое масло  с плотностью 0,8-0,9. Предварительно масло  стерилизуют 1 ч в автоклаве при 121⁰ (1 ати), а затем для удаления влаги прогревают в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше 150⁰ или оставляют на двое - трое суток при комнатной температуре. Культуры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4-6⁰.

     Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишки масла проведением  петли по стенке пробирки, переносят  на свежую питательную среду. Рекомендуется  использовать среду того же  состава, на которой культуру хранили. Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость роста их восстанавливается.

     Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым  маслом прост, удобен в обращении, может быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.

     Хранение  в лиофилизированном  состоянии. Хранение лиофильно-высушенных клеток широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лиофильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10-20 и более лет сохранить  без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток.

     Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания  формирования покоящихся форм. Затем  клетки или соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных  жидкостях, получивших название защитных сред. В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания. Ниже приведены рецепты защитных сред, используемых для лиофилизации клеток различных микроорганизмов: 

     Для успешной лиофилизации плотность в  защитной среде должна быть как можно  более высокой – 10⁹-10¹⁰ клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5-1,0 мл, замораживают при температуре от -20 до -70⁰, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофизированных клеток колеблется от 1 до 6% и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируются и во многом зависят от имеющегося оборудования. Ампулы с лиофильно-высушенными клетками рекомендуется сохранять в темноте при температуре 4-60. хранение при более высокой температуре, особенно превышающей 25-300, заметно снижает выживаемость клеток.