Характеристика микроорганизмов, вызывающих разные брожения

     Для более точной дифференциации этих двух микроорганизмов требуется полный анализ брожения. Это, конечно, самый точный, но и самый трудоемкий способ. В повседневной практике для заключительной дифференциации используют метод, основанный на качественных различиях между двумя рассматриваемыми видами бактерий. Учитываются следующие показатели: 1) образование индола из триптофана; 2) количество кислоты, образуемой из сахара (проба с метиловым красным); 3) образование ацетоина при сбраживании глюкозы (реакция Фогес - Проскауэра) и 4) рост на среде с цитратом в качестве источника углерода.

     Продукты  брожения и метаболические пути. При брожениях, вызываемых факультативными анаэробами, в том числе представителями Enterobacteriaceae, многими видами Bacillus и другими бактериями, образуется большое число различных соединений, среди которых преобладают органические кислоты. Важнейшими продуктами брожения являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, глицерол, ацетоин, 2,3-бутандиол, СО₂ и молекулярный водород. Гексозы расщепляются в основном по фруктозобисфосфатному пути и только в незначительной части- по пентозофосфатному. Разложение глюконата идет по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути.

     В зависимости от того, какие продукты брожения выделяются в анаэробных условиях, различают два типа процессов: а) при брожении, характерном для Escherichia coli, образуются главным образом кислоты и совсем не образуется бутандиол; б) при брожении, характерном для Enterobacter, основной продукт- бутандиол, кислоты же занимают второе место. Два указанных типа брожения различаются главным образом по реакциям, связанным с превращениями пирувата.

     Особенности брожения, осуществляемого  Escherichia coli. Для этой бактерии характерны следующие особенности брожения; 1) расщепление пирувата с образованием ацетил-СоА и формиата; 2) разложение формиата на СО₂ и молекулярный водород; 3) восстановление ацетил-СоА до этанола; 4) отсутствие способности образовывать из пирувата ацетоин и 2,3-бутандиол.

     Превращение пирувата в ацетил-СоА и формиат  происходит только в анаэробных условиях; его катализирует пируват : формиат-лиаза. Этот фермент чрезвычайно чувствителен к кислороду, удерживается флаводоксином в восстановленном состоянии и для своей активации нуждается в S-аденозил-L-метионине.

     Особенности брожения, осуществляемого Enterobacter aerogenes. Эта бактерия в анаэробных условиях тоже образует целый ряд кислот; в количественном отношении они, однако, существенно уступают ацетоину и 2,3-бутандиолу. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата. Процесс включает двукратное декарбоксилирование. Образование нейтрального продукта брожения-будандиола-в известной мере конкурирует за промежуточный продукт-пируват, подавляя тем самым синтез кислот.

     С другой стороны, образование бутандиола связано с дополнительным освобождением СО₂. Количество дополнительно образуемой двуокиси углерода находится в стехиометрическом соотношении с количеством бутандиола. Некоторая часть СО₂ образуется при расщеплении формиата, однако основное ее количество выделяется в процессе образования бутандиола. Своим названием Enterobacter aerogenes обязан, как уже говорилось, очень интенсивному выделению газообразных продуктов. Соответствующие отличия от брожения, осуществляемого Escherichia coli, составляют основу для применения пробы с метиловым красным и проведения реакции Фогес-Проскауэра на ацетоин.

       Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, B. polymyxa, Serratia, Aeromonas hydrophila и некоторых других бактерий образование бутандиола идет через 2-ацетиллактат. Брожение с выходом бутандиола находит применение в промышленности.

     При окислении ацетоина кислородом воздуха  легко образуется сходное с ацетоином соединение диацетил. Его выделяют и различные молочнокислые бактерии (Leiiconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum), добавляемые к молоку специально для этой цели в процессе приготовления молочнокислых продуктов (масла, йогурта). Диацетил придает продукту запах масла. У названных бактерий он синтезируется не через 2-ацетиллактат, а из гидроксиэтил-тиаминпирофосфата и ацетил-СоА.

     4. Светящиеся бактерии и биолюминесценция

     Светящиеся  бактерии  в основном морские  организмы. Это хемоорга-нотрофные бактерии, по своим морфологическим и физиологическим признакам сходные с Enterobacteriaceae; поэтому их называют также «морскими энтеробактериями».

     Светящиеся бактерии легко выделить из морской и солоноватой воды. На мясе и рыбе они образуют естественные накопительные культуры, особенно при низких температурах. Если морскую рыбу в неглубокой посуде наполовину залить соленой водой и оставить на несколько дней в холодильнике (при 4-6°С), то на поверхности рыбы появятся колонии светящихся бактерий, которые можно выделить и получить в чистой культуре. Как правило, они не вызывают гниения и не образуют токсичных веществ, но выделяют амины. Р. Бойль (1667) писал: «Иной кусок мяса вчера еще светился, а сегодня из него уже приготовлено Питательное и вкусное блюдо».

     Светящиеся  бактерии. Все выделенные до сих пор светящиеся бактерии - грам-отрицательные факультативные анаэробы, передвигающиеся с помощью 1-8 жгутиков. В зависимости от морфологии жгутиков (полярное или перитрихальное расположение, простые жгутики или жгутики в чехле) их относят к родам Photobacterium или Вепескеа. В анаэробных условиях большинство светящихся бактерий осуществляет муравьинокислое брожение или брожение смешанного типа, как это свойственно Enterobacteriaceae, и образует муравьиную, уксусную, молочную и янтарную кислоты, спирт, СО₂ и ацетоин. Как и многие другие морские бактерии, они являются галофилами; если поместить их в гипотоничную среду (дистиллированную воду), они мгновенно лизируются.

     Рост  и биолюминесценция в сильной  степени зависят от состава среды. Свечение наблюдается только в присутствии кислорода, поэтому такие бактерии еще в конце прошлого века использовались как чувствительные индикаторы для выявления фотосинтетического образования кислорода у зеленых и красных водорослей в опытах со светом разной длины волны.

     Процесс свечения. Свечение следует рассматривать как процесс аэробного окисления, своего рода побочный путь дыхания, приводящий не к образованию АТР, а к возбуждению какого-то промежуточного продукта, испускающего при этом свет. Дюбуа первым в 1885 г. исследовал процесс свечения, использовав водные экстракты из светящегося органа моллюска-точильщика Pholas dactylus.

     В разных системах вещества, участвующие  в биолюминесценции, различны. Лучше всего этот процесс изучен у Photinus pyralis - американского светлячка. Люциферин его люминесцентной системы оказался производным бензтиазола.

     Между количеством вступившего в реакцию АТР и интенсивностью свечения существует прямая зависимость. Поэтому «светлячковая реакция» стала излюбленным методом количественного определения АТР. 

     5. Маслянокислое и ацетоно-бутиловое брожение;

     клостридии

     Масляная  кислота (бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и спиртов являются типичными продуктами сбраживания углеводов анаэробными спорообразующими бактериями (клостридиями). Поэтому клостридии, а также некоторые специализированные виды, сбраживающие только этанол, аминокислоты или иные вещества, рассматриваются здесь в связи с маслянокислым брожением, которое они вызывают.

     Признаки. Род Clostridium относится к семейству Bacillaceae. Как и другие представители этого семейства (Bacillus, Sporolactobacillus, De-sulfotomaculum и Sporosarcina), клостридии грам-положительны. Благодаря перитрихально расположенным жгутикам они очень подвижны. Вегетативные клетки палочковидные, однако форма их может изменяться в зависимости от условий среды. Овальные или шарообразные эндоспоры изменяют форму палочковидной материнской клетки, так как их диаметр, как правило, больше толщины этой клетки. Споры терморезистентны.

     Физиологически  клостридии отличаются резко выраженным бродильным типом метаболизма, а также чувствительностью к кислороду: они растут только в анаэробных условиях. Однако существуют, по-видимому, все переходные формы-от строго анаэробных видов (Clostridium pasteurianum, С. kluyveri) до почти аэротолерантных (например, С. histolyticum, С. acetobutylicum). Клостридии, как правило, не содержат гемопротеинов (цитохромов, каталазы). Некоторые виды способны, однако, образовывать цитохромы, если в питательной среде содержатся их предшественники. Из запасных веществ широко распространены крах-малоподобные полисахариды.

     Температурный оптимум для роста большинства  известных видов Clostridium лежит между 30 и 40°С. Наряду с этими мезофильными представителями встречается много термофильных видов с оптимумом 60-75°С, таких как С. thermoaceticum и С. thermohydrosulfuricum. Подобно

     другим  представителям Bacillaceae, клостридии способны расти только при нейтральной (или щелочной) реакции среды. Поэтому их рост, часто нежелательный, может быть полностью подавлен при подкислении (например, в квашеной капусте, силосе, фруктовых консервах, сырых колбасах).

     Субстраты. Клостридии весьма сильно различаются в отношении субстратов, которые они могут использовать и сбраживать. Некоторые виды мало разборчивы и используют широкий круг веществ, другие узко специализированы и способны сбраживать лишь один или несколько субстратов. В целом же клостридиям доступно множество различных природных соединений. Они способны разлагать полисахариды (крахмал, гликоген, целлюлозу, гемицеллюлозы, пектины), нуклеиновые кислоты, белки, аминокислоты, пурины и пиримидины. Одним клостридиям нужны сложные питательные среды или ростовые вещества, другие в них не нуждаются. Некоторые могут обходиться молекулярным азотом как единственным источником этого элемента; азот они связывают с большой скоростью (Clostridiwn pasteurianum).

     По  способности использовать различные  субстраты клостридии можно подразделить на ряд групп. Сахаролитические клостридии расщепляют преимущественно полисахариды или сахара. Пептолитические клостридии расщепляют белки, пептоны и аминокислоты. Группы в свою очередь объединяют на основе типов брожения и его продуктов .

     Для получения накопительных культур  видов Clostridium можно воспользоваться некоторыми их особенностями. Поскольку их споры терморезистентны, инокулят предварительно пастеризуют. Создавая строго анаэробные условия, заранее исключают рост всех аэробных бактерий. Так как некоторые бактерии, расщепляющие полисахариды, прикреплены к поверхности частиц, например к крахмальным зернам или к частицам целлюлозы в рубце жвачных или каких-то осадках, эти частицы можно сначала промыть, чтобы освободить их от других бактерий, а затем использовать как материал для инокуляции. Для поддержания способности к интенсивному брожению нужно и в последующей работе с выделенными штаммами всегда пользоваться пастеризованными инокулятами.

     Биохимия  брожения и его  продукты. При брожении образуются в разных соотношениях кислоты (масляная, уксусная, молочная), спирты (бутанол, этанол, 2-пропанол), а также ацетон и газообразные продукты (Н₂ и СО₂). Клостридии расщепляют глюкозу по фруктозобисфосфатному пути. Водород, освобождающийся при дегидрировании глицераль-дегидфосфата, переносится, как правило, на органические кислоты иди кетоны, образуемые из пирувата или ацетил-СоА. Прототипом брожения, осуществляемого клостридиями, можно считать сбраживание глюкозы Clostridium butyricum и С. acetobutylicum; при этом образуются бутират, ацетат, бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, СО₂ и Н₂. Выход продуктов варьирует в зависимости от условий.

     Сбраживание этанола и ацетата. Из накопительных культур Мethanobacterium omelianskii, содержавших в качестве субстрата этанол, была выделена анаэробная спорообразующая бактерия, которая наряду с этанолом нуждается и в ацетате. Эта бактерия - Clostridium kluyveri-превращает смесь уксусной кислоты и этанола в масляную и капроновую кислоты и молекулярный водород. Ацетат служит дополнительным акцептором водорода, и он образуется в ходе брожения. АТР синтезируется только при ацетаткиназной реакции.

     Сбраживание лактата и ацетата. Из накопительных культур, содержащих в качестве субстрата лактат, была выделена бактерия Clostridium tyrobutyricum, которой тоже необходим ацетат как дополнительный акцептор водорода, если главным субстратом служит лактат или глицерол.

     С. tyrobutyricum сбраживает глюкозу по схеме, известной для С. butyricum, не нуждаясь в экзогенном акцепторе водорода. 

     6. Маслянокислое и уксуснокислое (ацетатное) брожение, осуществляемое неспорообразующими бактериями.

       Некоторые роды анаэробных бактерий близки к клостридиям по продуктам брожения; они, однако, не образуют спор, и многие из них грам-отрицательны. Большинство таких бактерий, образующих масляную и уксусную кислоты, было выделено из рубца, где они участвуют в разложении целлюлозы, крахмала и других углеводов. Они выделяют много молекулярного водорода и СО₂ и создают метаногенным бактериям условия для образования метана. Из бактерий рубца, образующих масляную кислоту, следует особо упомянуть Bytyrivibrio fibrosolvens, а из обитающих в рубце продуцентов уксусной кислоты - Ruminococcus albus. Этот последний вид  строгий анаэроб, использующий целлюлозу и ксилан, а также многие сахара. Он способен превращать 1 моль глюкозы в 2 моля ацетата, 2 моля СО₂ и 4 моля Н₂-правда, при условии, что концентрация выделенного водорода поддерживается на низком уровне. Это возможно в смешанной культуре с какой-либо бактерией, использующей водород, например Vibrio succinogenes. Из приведенной схемы видно, что при чистом ацетатном брожении может быть образовано 4 моля АТР на 1 моль глюкозы. Столь высокая эффективность регенерации АТР возможна, однако, лишь в том случае, если все возникающие при расщеплении глюкозы восстановительные эквиваленты будут освобождаться в виде молекулярного водорода.

     6.1. Клостридии — возбудители болезней и продуценты токсинов.

     Некоторые пептолитические клостридии могут быть возбудителями болезней при раневой инфекции (газовая гангрена и столбняк), а также причиной пищевых отравлений. Споры их очень распространены в почве. Если споры Clostridium histolyticum или С. septicum попадают в открытую рану, к которой нет доступа воздуха или где аэробные бактерии, потребляя кислород, создают анаэробные условия, то эти клостридии начинают расти, расщеплять с помощью протеиназ коллаген и другие белки, вызывать образование дурно пахнущих продуктов брожения и газа. С такого рода газовой гангреной («госпитальной гангреной») в прежние времена можно было бороться только путем ампутации пораженной конечности. С раневой инфекцией связан и до сих пор еще нередко встречающийся столбняк. Его вызывает Clostridium tetani. Эта бактерия при своем росте выделяет очень сильный нейротоксин, вызывающий тонические судороги мышц.