Шпаргалка по "Геномике"

1. Обеспечивает рекомбинацию и разрезание коинтеграта.
2. Контролирует транспозицию. Связываются межгенные области, одновременно выключается ген транспозазы и резолвазы, т.е. включается репрессор.

Когда случайным  образом идёт перемещение, то идёт акт транскрипции транспозазы. tnpR ->  траскрипция идёт  ->  большое количество белка ->  транспозаза выключается. Перемещения транспозонов не происходит.

Стандартная ситуация, когда  они начинают прыгать: когда на коньюгативной  плазмиде транспозон попадает в клетку, в клетке репрессора нет, значит транспозаза активна, идёт перемещение.

Транспозоны оказались очень  удобным экспериментом для работы в лабораторной практике, т.к. можно  сделать всякие производные, которые  можно использовать для специфических целей Здесь показано, что сделано на основе транспозона Tn5. Это мини-транспозон. Как было выяснено на прошлых лекциях, транспозаза взаимодействует с инвертированными повторами, т.е. то , что нужно трнанспозазе – это короткие инвертированные повторы, приблизительно 20p.n. по концам транспозона. На схеме они показаны узенькими прямоугольниками. Между этими повторами можно поместить любой фрагмент ДНК. Если повторы в инвертированной ориентации, то фрагмент ДНК будет перемещаться, но, где-то рядом должен быть ген транспозазы, он должен присутствовать в той же молекуле ДНК, т.к. транспозаза действует в цис-положении. На слайде система для мини-транспозона, состоящая из векторной плазмиды, в которой встроен ген транспозазы, имеется полилинкер, который клонируется в производной транспозона.

Какие производные транспозоны  существуют:

1. Серия, которая отличается  генами антибиотикорезистентностью: тетроциклин, стрептомицин, несколько кономициновых и др.

 Серия, которая  более интересная: кроме гена  антибиотикорезистентности присутствует репартерный ген – ген, который кодирует какой-нибудь  фермент , но не совсем полноценно.У него отрезано начало, т.е. нет промотора, а в некоторых случаях рибосом связывающих сайтов. СЛАЙД

Если посмотреть какие гены на рис  есть, то это бета-галактозидаза( 2 вариантабез промоторный и не изученный ), щелочная фосфотаза, катехол-2-3 –диоксигиназа и люцефераза. Т.е. каждый из этих генов после встраивания в геном должны быть либо в той же ариентации, либо в противоположенной. Е6сли ариентация правильная, то  репартерный ген попадает под чужой промотор, начинают экспрессироваться фермены и по количеству фериента можно определить уровень экспрессии гена ( у нас в лабе используется ген катехол т.к. очень дешевый и доступный субстрат ).

Вопрос  № 14. Особенности организации генома позвоночных.

Когда мы говорим о количестве генов и я называю цифру в районе 25 тыс. вот эта цифра является фактически максимумом для животного если взять нас с вами если взять туже мышь или даже примитивное позвоночное животное у них у всех примерно около 25 тыс генов. Если взять беспозвоночное животное, то там только на 10 тыс генов меньше. Но это не означает что у нас практически одинаковая организация. Фактор который обязательно необходимо иметь ввиду, это то что в геномах позвоночных, точнее в клетках позвоночных гораздо шире идут процессы альтернативного сплайсинга и альтернативного полиаденилирования, альтернативный пути процессинга первичных транстриптов. В связи с активным использованием этих альтернативных путей с одного набора генов мы с вами можем получить как минимум в 2 раза больше белков а то и в 3 раза, т.е эти цифры точно пока ещё не определены, т.к это очень сложно сделать технически, но факт тот что как минимум в 2 раза больше белков, т.е у нас не меньше 50 тыс белков и оценки варьируют то 50 до 100 тысяч в организме человека. Понятно что эти различные белки будут созданы из одних и тех же строительных блоков – домены будут теже, но ра счёт разных комбинаций мы получаем разные функции и естественно это немного разные белки и получается большее разнообразие.

Так значит, на самом деле наше представление о  геноме человека уже сложилось после  завершения основной фазы геномного  проекта, после того как были секвенированы  следующие позвоночные животные (рис. 9.31)

Ну вот наиболее важные из них это мышь, крыса, рыба фугу, про это организм мы чуть попозже  поговорим и собака обычная. Т.е тщательный анализ этих геномов позволил уточнить и количество генов и количество экзонов, поскольку геномы оказываются во многом сходными, одинаковыми структурами, размер практический тот же самый, за исключением рыбы фугу. И первый такой анализ был сделан с мышью. И следующие несколько слайдов будут в основном про мышь.

Вот в частности, я уже говорил что наш с  вами генов где-то на 50% состоит из транспозонов, такая же цифра характерна для любого другого позвоночного, разница заключается в том что это будет просто другой набор транспозонов, и если брать любое другое позвоночное животное, то оказывается что в его геноме оказывается гораздо больше активных транспозонов. У нас с вами фактически один прыгает, а геномах других позвоночных  активны обычно все классы МГЭ включая ДНК-транспозоны. Детально мы останавливатся на этом не будем.

Здесь представлены (рис.9.32)те элементы с которыми мы уже хорошо знакомы

Внизу у нас  человеческий геном и те транспозоны  на которых мы с вами останавливались  это LINE элементы и Alu последовательность. Тут хорошо видно где они распространяются. Те транспозоны и ядерные элементы которые активны имеют тенденцию скапливаться в АТ богатых местах, а Alu в кодирующих областях. Приблизительно такая же ситуация наблюдается и в геноме мыши вот LINE последовательность располагается, она похожа на LINE элементы в нашем с вами геноме, а вот это «сайн» элементы которые проэктируют на терментном аппарате LINE последовательности, у мыши просто нету основного «сайн» элемента у них просто части……примерно равнозначны, но суммарно это выглядит так как и у нас с вами. LINE элементы крупные имеют тенденцию накапливаться в интегрирующих областях, а «сайн» элементы не большого размера тяготеют к кодирующим областям, т.к скорее всего здесь также они имеют позитивное значение для функционирования генома.

Важный аспект этих сравнений это расположение синтеничных последовательностей (синтения – это упорядоченное расположение кодирующих участков с одинаковой функцие). Здесь вот (рис.9.33) показаны экзоны расположенные на фрагменте 2-х хромосом  человека и мыши, линия которая соединяет эти 2-е хромосомы нарисована там где экзоны имеют сходство, т.е если вы посмотрите порядок один и тот же, порядок ровно выдерживается, немножко меняется расстояние где-то произошла делеция или наоборот здесь какой-то транспозон встроился, а так последовательность кодирующих участков совпадает и такие вот протяженные участки могут занимать миллионы нуклеотидных пар и они оказываются видны при более крупном масштабе.

Вот здесь вот (рис.9.35) показан весь хромосомный набор мыши раскрашенный в соответствии с тем какой человеческой хромосоме наблюдается сходство. Если внимательно посмотреть на эти участки, то имеются огромные куски полностью синтеничные  нашей с вами хромосоме. Т.е в этих участках мышь от нас не отличается практически ничем, конечно я утрирую немного, но по крайней мере последовательность генов та же самая, т.е эти участки практически не видоизменялись разве что точечные мутации, но существенных реорганизаций не происходило и в целом для большинства позвоночных животных характерно приблизительно одно и тоже число хромосом, отличие обычно на одну две хромосомы.

А вот очень  интересный организм (рис.9.36) Рыба фугу, их есть несколько видов и секвинировали различных представителей, первым был Tetraodon, а потом таки фугу тоже была секвенирована. Эти позвоночные животные при том что они содержат тоже самое количество генов 25 тыс. и длина кодирующих последовательностей практически та же самая  что и у нас с вами и гены не короче, у неё очень компактный геном, практически одну десятую от нашего. Почему такое возможно, оказывается что в геномах этих рыб существенно уменьшено число некодирующей ДНК, т.е нету того балласта который есть в нашем с вами геноме это сведено до минимума. Что показывает что геном позвоночных вполне нормально может функционировать и без всего этого мусора и не плохо себя чувствует.

(Рис.9.37) Тщательный  анализ сходства между синтеничными участками хромосом позвоночных и в частности здесь особое значение имеет рыба фугу позволяет предположить каким был хромосомный набор нашего с вами предка, т.е он практически наверняка имел 12 хромосом которые в какой-то момент времени были дуплицированы, и поэтому получаем 24 хромосомы часть которых была утрачена за счёт слияния. Поэтому у современных позвоночных около 20 с небольшим хромосом и во многих случаях они стали крупнее по крайней мере в этой эволюционной линии за счёт транслокация, за счёт слияния, за счёт инсерций большого количества транспозонов.

Теперь давайте  немного о траглодитах побеседуем. (рис.9.38)

Шимпанзе –  самый близкий наш родственник, поэтому особый интерес к геному этого организма поскольку точно разобравшись с тем как работает геном шимпанзе можно делать кое какие выводы о том чем пренципиально мы от них отличаемся. Делать окончательные выводы пока рановато, одна из причин почему рановато, ну качество этого сиквенса не очень высокое, сделан совсем грубый черновик, сколько денег было столько и пустили, это опубликовано в 2005 году анализ, такого вот чёрного черновика. Ну, геном того же самого размера и очень важная цифра это вот эта, то что последовательность очень и очень сходна с нашей с вами т.е это очень много для позвоночных  с этими их геномами которые накапливают огромное количество транспозонов  и прочего всякого мусора, сходство ну почти сто процентное т.е действительно очень много. Где эти отличия располагаются? У нас примерно около 35 млн нуклеотидных замен и 5 млн инсерций делеций и незначительное количество хромосомных перестроек. Ну что бы у вас было представление о масштабах этих сравнений, я уже говорил или не говорил, о том каков полиморфизм внутри человеческой популяции, даже внутри популяции одной рассы не считая различия между расами, стандартный уровень полиморфизма одна десятая процента, т.е два человека отличаются друг от друга на одну десятую процента, реально уровень полиморфизма оценивают в один миллион нуклеотидных пар отличающихся, если принять различные расы.

Частота одиночных  замен порядка 1%. Очень важный показатель – это дивергенция регуляторных областей, она хорошо изучена, это CpG-острова, которые помечают промоторные области, вот тут вот дивергенция оказывается значительно выше, чем по всему геному, здесь вы видите до 20 и больше замен против однозначных цифр по остальному геному. Интересным оказывается то, что при таком уровне различий около третьей части белков оказываются одинаковыми, замены заменами, но значительная часть этих замен оказывается молчащими, поскольку они попадают на третье основание в кодоне и соответственно это не влияет на АК-последовательность, т.е треть идентичная, а в среднем около двух АК-замен произвольно взятые белки будут, не факт что эти АК-замены меняют функцию белков, т.е на уровне белков сходство оказывается гораздо выше и разница вообще на самом деле не просматривается. SINE – элементы оказываются у человека активнее, а о транспозонах никаких осмысленных заключений сделать нельзя. 

Давайте посмотрим  следующее (рис.9.41)

Самое интересное о чём можно говорить при сравнении  геномов человека и шимпанзе, это  собственно говоря, где располагается  разница между нашими геномами и  собственно говоря, что делает человека человеком. Этот анализ на самом деле делать очень, очень сложно. Ну, первая попытка была сделана и результаты приведены на этом слайде. Во-первых сначала ищут ортологию, это делать сложно и понятно что из 25 тыс генов приходится браковать многие и оставлено было 13 тыс приблизительно половина, были приняты за гипотезу что они являются ортологичными. Затем в этих вот парах генов было проверено, на сколько часто происходит АК-замены, т.е мы знаем среднюю частоту АК-замен по геному и из этих 13 тыс были выбраны те из них, которые разошлись по максимуму, т.е если происходит больше замен чем в среднем по геному, то значит есть строгий естественный отбор, мощная селекция на накопление этих замен и такие варианты отбираются и соответственно можно предполагать что именно эти белки обеспечивают то отличие на фенотипическом уровне между шимпанзе и человеком. Т.е таким образом удалось отобрать около 600 белков которые отклонились существенно больше чем должно было быть статистически, но к сожалению за относительно низкой дивергенцией и неточность этих измерений где-то половина этих белков чисто случайно подходила. И когда пытались проанализировать какие собственно говоря белки попадают сюда, каких-то грандиозных выводов сделать нельзя, но по крайней мере однозначно сюда попадают белки которые отвечают за работу иммунной системы, ну вот два основных из них показаны вот здесь, ну это не единственные, а наиболее хорошо изученные, белки которые отвечают за работу иммунной системы и белки которые отвечают за репродукцию, т.е фактически получается что репродуктивное поведение поменялось, устойчивость к каким-то заболеваниям и возбудителям этих заболеваний, ну ничего такого что бы повлияло на работу мозга допустим или на прямохождение выявить не удалось. Ну понятно что анализ достаточно грубый и врядли можно было что-то ожидать. Здесь даже с точки зрения такого анализа получается что такой серьёзной разници между шимпанзе и человеком нет.

А вот ещё  один интересный слайд, который заостряет  внимание на одном аспекте сходства и различий человека и шимпанзе (рис. 9.42) Вот здесь вот показано различие между  отдельными хромосомами человека и шимпанзе, ну вот у шимпанзе эти 2 хромосомы слились, поэтому они здесь парой идут. Ну, если посмотреть по аутосомам, то стандартное различие получается чуть более процента, совсем другая картина если посмотеть на половые хромосомы, с одной стороны получается что Х-хромосома человека гораздо ближе к Х-хромосоме шимпанзе чем любая из аутосом, с другой стороны У-хромосома гораздо дальше оказывается, из чего можно сделать один очень простой вывод: если брать самцов, то это очень далёкие организмы, а если самок, то вот это вот разхождение то оно находится на грани внутрипопуляционного полиморфизма.