Шпаргалка по "Геномике"

Вопрос  № 13. Классификация, строение, основные свойства и распространение мобильных генетических элементов прокариот.

Большая часть  повторов в длину представляет собой  часть мгэ. Хочу сразу заострить ваше внимание: кажется, что большая часть мгэ это мусор, но он не так бесполезен, как кажется, потому что он делает возможными эти события. А эти события – двигатель эволюции. В эволюции виды утрачивают приспособленность и будут элиминироваться. На самом деле, все эти повторы во многих случаях оказываются весьма полезны.

Теперь давайте  разберемся с мгэ, которые обеспечивают очень быструю эволюцию прерывистые  эукариотических геномов.

 

Это общая схема, которая показывает структуру практически любого мгэ. Стандартно, есть средняя часть, которая кодирует ген, содержащий необходимый для перемещения фермент – транспозазу. Центральная часть обычно ограничена набором повторов, чаще всего относительно длинные инвертированные повторы с прямыми повторами по концам (прямые обычно короче инвертированных, но есть варианты). Это общая схема строения, но могут быть вариации.

Эта схема показывает, откуда берутся прямые повторы в  геноме. Любой домен, который обеспечивает перемещение мгэ, разрезает ДНК в точке инсерции транспозона ступенчато. Размер этой ступеньки может быть разный, но это всегда ступенька, потому что срабатывают две молекулы фермента. То есть у нас получаются липкие концы, затем к ним присоединяется транспозон, а бреши застраиваются стандартной системой репарации. Мы получаем дуплицированные последовательности вот этих липких концов.

 

Пару слов про  бактериальные транспозоны. Бактериальные  транспозоны есть огромное количество, но они изучены гораздо лучше(структура, механизм перемещения), чем эукариотические транспозоны. Первые транспозоны были открыты у эукариотов Барбарой МакКлинток.

Бактериальные транспозоны можно классифицировать по нескольким критериям. Самая старая классификация разбивает все  мгэ прокариот на собственно транспозоны и IS – элементы. Разница в том, что в состав последних не входит ничего кроме минимального набора генов, необходимого для транспозиции – инвертированные повторы плюс ген транспозазы. В транспозоны входят ещё дополнительные гены.

 

Вот в частности, бактериафаг Мю. Очень крупный транспозон, но транспозон. Есть инвертированные повторы, ген транспозазы и другие гены, в частности, гены фаговой оболочки.

 

Транспозоны можно  классифицировать по другому критерию – их можно разбить на простые  и составные. Составной траспозон составлен из простых мгэ, как правило, это IS – элементы. Классический пример, когда два IS – элемента ограничивают относительно короткий участок ДНК, длинной несколько тысяч пар нуклеотидов, в котором располагается ген пбс 370. Каждый из IS – элементов в составе такого транспозона может перемещаться автономно, но обычно один из них выключается за счет какой-нибудь мутации. Тогда активен только один элемент, но этого достаточно для перемещения, т.к. есть транспозаза, которая обеспечивает перемещение.

Понятно, что  раз есть составные транспозоны, есть и простые. Бактериофаг Мю простой  транспозон. Имеет размер около 140 000 п.н., до считается простым, потому что нету инвертированных IS – элементов на концах, только коротенькие – 20 нуклеотидных пар инвертированные повторы на концах.

Составной транспозон – это искусственное образование, он может формироваться в любой  момент. Вот здесь показан пример. Если у нас есть транспозон и мы его встроим в плазмиду, получается что у нас есть два IS – элемента, ограничивающие два участка ДНК. На первый взгляд и не скажешь, где тут транспозон составной.

И как показывает практика возможны два варианта транспозиции. Прямая транспозиция – когда перемещается сам транспозон; инвертированная  транспозиция – когда перемещается часть плазмиды, которая ограничена IS – элементами. Так происходит потому что ген транспозазы, взаимодействующий с инвертированными повторами. Если посмотреть на составной транспозон, то таких повторов оказывается четыре, причем они эквиваленты и со всеми может взаимодействовать транспозаза. Единственное требование – повторы должны быть инвертированными, тогда всё что между ними расположено будет перемещаться.

 

В геноме каждой бактерии находятся около десятка IS – элементов. Они различаются по своему размеру, по размеру инвертированных повторов и по размеру дупликации в точке инсерции (размер таких дупликаций обычно 9 пар, но может быть от 4 до 13). Ещё одно отличие, которое есть между разными мгэ – это специфичность инсерции в различные участки генома. В частности, есть несколько мгэ, которые встраиваются в практически произвольный участок, в частности 903 очень удобен и часто используется для мутагенеза. Второй наиболее часто используемый – это Tn 5 транспозон, по концам которого находится Is 50. Этот элемент интересен – у него есть небольшое количество горячих точек, располагается произвольно по геному и удобен для мутагенеза.  Is 50 менее удобен, но последовательность которую он распознаёт встречается достаточно часто. Здесь примеры мгэ, которые встраиваются в ненужные участки – это КН 7 (встраивается в один единственный локус в геноме E. coli ).

Я рекомендую вам  читать репликативную транспозицию по учебнику Спирина.

Что происходит при любой транспозиции? Начинается всё с того, что фермент транспозаза распознает инвертированные повторы по концам транспозона и делает надрез обеих цепей, но с разных сторон. Затем этот комплекс делает надрезы в сайте-мишене, то есть каждая из молекул транспозазы делает ступенчатый надрез и тут же воссоединяет две пары концов друг с другом и мы получаем вот такую промежуточную структуру. Получается, вот донорная молекула и к точкам разрывов присоединены кусочки реципиентной молекулы и с каждой стороны есть 3прим и 5прим концы. Дальше события двигаются по двум путям. В том случае, когда это распознаётся клеткой, как репликативная вилка, происходит репликативная транспозиция – ДНК полимера здесь связывается и реплицирует вот эту часть. Получаем в тоге две копии транспозона. Альтернативный вариант – когда транспозаза делает надрез и в альтернативных цепях. Копия транспозона оказывается полностью вырезанной из донорной молекулы и присоединяется к реципиентной молекуле. Это называется консервативная транспозиция. Детали могут различаться, в зависимости от транспозона, но суть та же самая. Непосредственный результат репликативной транспозиции, в том случае, когда донорный и реципиентный репликон являются кольцевыми (чаще всего бывает в бактериальной клетке), является коинтеграт, то есть два объединенных репликона. Транспозону это не выгодно. Вообще, транспозон – это паразит на субклеточном уровне, потому что для бактериальной клетки вероятность того, что транспозон сделает для клетки что-то хорошее очень и очень низкая. Транспозон – это молекула ДНК, которая стремится максимально размножиться, но есть ограничение со стороны бактериальной клетки на увеличение генома (геном начинает плохо реплицироваться, не хватает энергии).

 

С точки зрения транспозона, эта ситуация очень  не выгодна, у нас было два репликона, а мы получили одну молекулу ДНК, то есть число носителей транспозона не изменилось. По этому, все репликативные транспозоны имеют систему разделения коинтеграта на исходные молекулы, но с копией транспозона.

Бактериофаг Мю. Это очень интересный транспозон, он способен перемещаться по двум механизмам – и по консервативному и по репликативному. Почему так происходит? Потому что бактериофаг мю даже в фаговой головке существует в виде транспозона. Что пакуется в фаговую головку? Геном фага с инвертированными повторами, плюс остатки геномной ДНК (пару сотен нуклеотидных пар остается). Так получается потому что, в ходе литического цикла транспозон активно скачет по хромосоме и получается несколько десятков копий. А затем фаговые ферменты нарезают эти все траспозоны вместе в фаговой ДНК и пакуют в головки. И когда такой фрагмент из фаговой частицы впрыскивается внутрь бактериальной клетки, происходит консервативная транспозиция. Транспозон просто вырезается из линейной ДНК и встраивается в новую хромосому. А в ходе литического цикла идет репликативная транспозиция и получается необходимое количество копий для упаковки фаговой частицы. Модификация процесса, то есть надрез в этих местах, дает консервативную транспозицию, то есть транспозон переезжает в новый репликон, а в старом остается двухцепочечный разрыв. Эта ситуация может показаться нелогичной с точки зрения эгоистичной ДНК, которая стремиться размножиться по геному, потому что не увеличивается число копий транспозона. На самом деле это не совсем так, потому что любой транспозон, который перемещается по консервативному механизму, имеет жесткую привязку к репликации донорной молекулы. Перемещение происходит только тогда, когда имеется больше одной копии геномной молекулы. Есть способ репарации разрыва за счет стандартной клеточной системы репарации. Если есть гомологичная молекула, то идет гомологичная рекомбинация и восстанавливается исходная копия транспозона. Это дополнительный уровень эксплуатации клеточных систем, после того, как транспозон уже переместился.

Этот слайд  показывает, как взаимодействует транспозаза с инвертированными повторами. На примере транспозона Tn5, его транспозаза взаимодействует с концами Is 50. Молекула транспозазы образует димер, в котором каждая молекула связывается с инвертированным повтором в одном месте, а активный сайт фермента располагается таким образом, чтобы осуществить надрез на границе другого конца с донорной ДНК. И то же самое с другой субъединицей транспозазы.

При консервативной транспозиции есть много вариантов  событий. Транспозиция вообще интересна тем что она идет без затрат энергии и это возможно за счет того, что используются механизмы сохранения энергии, в частности, когда транспозаза атакует концы транспозона, то с одной стороны остается гидроксил, а с другого конца фосфатная группа ковалентно связывается с транспозазой через тирозиновый остаток и таким образом энергия, которая есть в фосфодиэфирной связи, сохраняется. Потом когда транспозон перемещается на новое место и надо восстановить эту связь, то фосфат переносится с тирозина и фосфодиэфирная связь восстанавливается. Ну а конкретные события могут отличаться. В некоторых случаях транспозоны могут вырезаться сразу с образованием двуцепочечного разрыва, иногда сначала делаются одноцепочечные разрывы, потом идет нуклеофильная атака гидроксил на другую цепь ДНК, в некоторых случаях образуются кольцевые интермедиаты – тогда гидроксил атакует другой конец транспозона. Но результат всегда получается один и тот же – полное вырезание копии транспозона из донорной молекулы ДНК и перемещение в реципиентную .

В прошлый раз  мы с вами начали разбирать классические бактериальные  транспозоны, которые  перемещаются  без промежутка и  интермедиата в виде РНК. Рассмотрим 2 механизма: консервативный и репликативный. Слайд 4,48,4.49

на слайде и  на слайде показано, что достаточно легко из общего интеграта ( всегда образуется в ходе транспозиции) получить либо консервативную транспозицию, либо репликативную. На слайде показана репликативная транспозиция- вырезание из донорной молекулы и встраивание в реципиентную.

Репликативная будет, если просто произойдет репликация структуры РНК.

Детали консервативного  мех-зма могут различаться в  зависимости от того, какая работает транспозаза.. когда транспозон полностью  вырезается и репликативные остатки  отакуют реципиентную молекулу ДНК, то фактически происходит реакция трансэтерификации. В результате получаются копии транспозонов в одном месте 
, в каком-то разные.отличия разные: а,в,с

-- транспозаза  может делать только одноцепочечные  надрезы, а затем гидроксил  может атакавать вторую цепь. Получается закальцованный транспозон, но после этой реакции происходит гидролиз  вот этой связи и окончательная стадия также.

-- когда гидроксил  атакует второй конец транспозона  и получается концевая структура. 

Результат тот  же во всех случаях: донорная молекула вырезана, а реципиентная встроена.

Есть  нестыковки : транспозон- это такая эгоистичная ДНК, которая стремиться размножиться в максимальном количестве копий и на первый взгляд консервативный мех-зм транспозиции не увеличивает на первый взгляд число транспозонов. Но не все так просто. Оказывается, что практически все транспозоны, которые учавствуют в репликативном мех-ме имеют четкую систему контроля экспрессии генов транспозазы.

Пока та молекула ДНК, в которой находится транспозон присутствует в клетке  в виде одной копии транскрипция закончена. Когда происходит репликация этой молекулы, активируется транспозаза генов транспозаз.

СЛАЙД?? у некоторых транспозонов  мех-зм изучен. В частоности ДНК транспозона все просто. У него промоторная  область генов присутствуют несколько сайтов ДНК активирования и в результате, в таком полностью метилированном состоянии эти сайты блокируют инициацию транскрипции. Поэтому  если после репликации он оказывается полуметилированным, то идет транскрипция точно также как контролируемая инициац репликация ДНК. Т.е. принцип один и тот же, но детали отличаются.

Суть в том, что в ходе метелированная ДНК  оказывается после репликации и  транскрипция активируется тогда, когда  есть ещё одна копия транспозазы.

В результате, когда мы получаем транспозан, который полностью вырезан есть где-то в геноме только что реплицированная копия комплиментарная, в которой этот транспозан будет присутствовать.

Согласно стандартному клеточному механизму репликации двухточечных разрывов и клеточной системы репарация рекомбинации восстанавливает транспозоны  в том месте, в котором он был вырезан. Получается, что перемещаются транспозоны тогда, когда есть возможность восстановления транспозона в исходном месте.

В конечном итоге  получается тоже, что и при репликативной транспореции. И там  и там для репликации копии транспозона используется клеточный аппарат, только по-разному.

 В первом  случае при репликативной транспозиции  сразу используется полимераза, при консервативной транспозиции ещё  добавляется система рекомбинации.

Как происходит восстановлении копии транспозона. (рисунок рисовал)

Вот у нас  ситуация: Разрыв, который остался, он – ступенчатый и другая молекула ДНК, в которой транспозон присутствует. Здесь начинают работать ??? связывается с этим концом и начинают работать.

Rep P белок обеспечивает миграцию.

Когдда говорили о репликативной транспозиции, мы пропустили момент: результат действия  репликативной транспозиции является коинтеграт.

Образование коинтеграта (рисунок)

Две копии транспозона, а молекула Днк – одна. Чтобы разделить эти молекулы используют сайт специфическую рекомбиназу. Т.е. происзодит рекомбинация между копиями транспозона и мы получаем оканчательный продукт транспозиции.

Коинтеграт  разделяется двумя путями:

1. Это может сделать стандартная клеточная система, гомологичная рекомбинация (То что нарисовано c учётом белка Rec A). Но неэффективно, т.к. в бактериальной клетке хорошо идёт  рекомбинация для тяжёлых участвок, т.к. транспозоны немного коротковаты. Частота процесса между двумя копиями транспозона 10^-4 – 10^-5 . Т.е. очень малая, чтобы гарантировать образование коинтеграта.
2. И поэтому используется сайт спецефическая рекомбинация. Она обеспечивается ферментом , который кодируется геном tnpR (

 Вот этот  ген кодирует сайт спецефическую рекомбиназу, а этот участок - res сайт, с которым взаимодействует белок. (Слайд ) В увеличенном виде он представлен здесь. Rec сайт представляет собой 3 повтора , каждый из которыхспособен связываться с молекулой регуляторного белка.

Молекула делает 2 вещи: