Шпаргалка по "Геномике"

 

 

 

 если это  вектор внедрения можно вставить около 5 тыс. если вектор замещения то чуть меньше 20 тыс. н.п. долгое время бактериофаги были векторами максимальной емкости, но в 70-80 гг бактериофаги использовались для конкретных геномных библиотек, затем были разработаны космидные векторы, гибрид бактериофага и плазмид, в них емкость ограниченна емкостью головки фага: cos-сайт, стандартная плазмида, в зависимости от того какого размера эта плазмида, максимальный размер – 53 тыс. н.п., который умещается в головку фага λ, минус геном плазмиды, минус фаговые нейтральные элементы получается где-то 40-45, максимум 48 тыс. н.п. которые можно поместить.(СМ СЛАЙД 4.11)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В начале 90гг активно  развивался вектор на основе бактериофага P1. он отличается от лямбды прежде всего значительно большей емкостью головки потому что более крупный геном и более того он существует в клетке бактериальной в виде кольцевой молекулы ДНК, т.е. его нормальная форма, лизогенная форма – это плазмидная форма, что несомненно удобно. Он не внедряется в хромосому, то есть имеются свои плюсы. Есть вектор на основе бактериофага P1, которые даже больше 100 тыс. н.п. могут клонировать. Специально под проект «геном человека» разрабатывалась группа векторов: дрожжевые искусственные хромосомы и мега-YAK , которые имеют еще большую емкость. А емкость у них колоссальная до млн. и даже больше н.п. Зачем такие векторы нужны? Вот здесь вот показано расчетное число клонов которое необходимо для того чтобы с указанной вероятностью иметь в составе библиотеки всю ДНК генома человека. Вот можете посмотреть (СМ СЛАЙД 4.10)

 

 

 

 

 

плазмиды сюда даже не помещаются потому что речь идет о многих млн. форм. Если посмотреть на эту колонку то даже вектор с  самой большой емкостью требует  десятков тысяч клонов. Соответственно если емкость падает то: космидные уже сотня тыс. и фаг λ уже приближается к млн. То есть огромное количество клонов которые можно получить.

Прорабатывали геном человека. К началу 90х гг.это  все было сделано, были созданы геномные библиотеки, человеческий геном в  векторах. Но их не используют для секвенирования потому что прежде чем с ними что-то делать нужно было дрожжевой геном секвенировать. Поскольку это все планируется в дрожжах выделяется из дрожжей, чтобы исключить контаминацию геномной дрожжевой ДНК нужно было сначала эту последовательность получить,  В результате то время которое ушло на секвенирование генома дрожжей. С этими векторами строили физические карты генома человека и они были построены, потом когда в 96 году геном дрожжей был наконец-то расшифрован и началось масштабное секвенирование генома человека с использованием этих векторов, выяснилась такая нехорошая штука – векторы  оказались очень нестабильными, они оказались клонами к реорганизации тех ДНК которые сюда вставлены, т.е. огромные фрагменты между ними перетасовываются – меняется расположение отдельных участков ДНК, происходили делеции крупных фрагментов и в результате после первых нескольких лет стало понятно что нельзя это использовать, поэтому срочно принялись разрабатывать другие векторы меньшей емкостью, но большей стабильностью. И это бактериальные искусственные хромосомы , фаговые хромосомы (ВАК и РАК) у которых размеры инсерций потенциально до трех сотен тыс. н.п. а реально используется где-то 100-150 сотен тыс. н.п. и это тот максимальный  размер который может  стабильно поддерживаться и с которого можно иметь надежную библиотеку. Речь идет нескольких тыс. клонов которые в этих векторах необходимы чтобы геном человека секвенировался. Ну давайте более подробно об этих векторах. Космида отвечает за плазмиду участком cos-сайта, в котором происходит разрезание кольцевой фаговой ДНК по которой происходит нарезание реплицированной ДНК в момент упаковки в головку т.е. cos-сайт необходим чтобы эта ДНК могла упаковаться. Должна быть стандартная точка начала репликации, какой-то селективный плазмидный маркер, участок для клонирования и cos-сайт. Вообще-то должно быть  2 cos-сайт, поскольку фаг λ нарезает конкатемеры, линейная ДНК в которых несколько геномов фага λ один к одному присоединяются поскольку репликация идет по типу катящегося кольца – разрезается между 2 cos-сайтами фрагмент и пакуется. С одним cos-сайтом запакуется только это менее эффективно. Несмотря на то что дрожжевые искусственные хромосомы имеются массу проблем они все равно используются при исследовании геномов, если нужен крупный фрагмент, а это как ни крути дрожжевые  искусственные хромосомы. И некоторые плюсы у них есть, первоначальные векторы у них модифицированы. С мега-УАК уже никто не работает т. к. больше млн. это уже лишнее, фрагменты по нескольку сотен тыс. в дрожжевых искусственных хромосомах более или менее можно надеяться что реорганизации не будет, а если ограничится 300ми тыс. проблемы почти что исчезают. Что из себя представляет такой вектор? (СМ СЛАЙД 4.12)

 

 

 

 Исходная  плазмида это обычный плазмида бактериальная в которую вставлено несколько фрагментов дрожжевой хромосомы, которые необходимы для ее репликации. Здесь есть центромерная последовательность, поскольку хромосома линейная, то 2 теломеры. в результате мы получаем своего рода минихромосому линейную с 2 теломерами, в центре присутствует центромера  Помимо тех участков которые необходимы для репликации дрожжевых векторов присутствует селективный маркер   X, Y, Z. Каким образом идет работа с этой молекулой? Сначала она переводится в линейную форму какой-нибудь рестриктазой, которая режет рядом с теломерными концами. В результате кольцующий фрагмент удаляется и мы получаем линейную хромосому, которая впоследствии разрезается ферментом в середине одного из маркеров (на слайде это Z). В итоге получается 2 плеча. Один маркер в одном плече, другой – в другом, а третий при такой рестрикции исчезает. Потом сюда добавляются нарезанные геномные ДНК и идет лигирование. В результате мы получаем, в качестве продуктов реакции лигирования некоторую часть молекул такой структуры (справа на слайде), и плюс еще лигированные друг с другом вот эти – по маркерам. Селекция по маркеру X, Y,отбирает те молекулы которые несут оба плеча, селекция на отсутствие маркера Z отбирает искусственные хромосомы со вставкой. Кроме того вот такая инверсия мини хромосомы она плохо реплицируется в дрожжах, потому что есть нижний предел в порядке 100 тыс. ниже которого искусственные хромосомы оказываются нестабильными. Таким образом трансформируется н.п. в сферопласты дрожжевые, трансформируемые клетки высеваются на селективную среду по двум маркерам (изопропилтермолактозидом ) таким образом можно получить библиотеку и поддерживать ее в дрожжевых вектора, что не рекомендуется. Обычно выделяется ДНК в этих минихромосомах .

Бактериальные искусственные хромосомы это  по сути просто-напросто бактериальная  плазмида. Большая часть батериальных искусственных хромосом является производным  фактора E. Coli, он низко копийный инициация его репликации привязана к инициации репликации хромосомы. Точка origin срабатывает также как и origin хромосомы плюс имеется Part-система – три гена которые обеспечивают четкое распределение этого вектора между дочерними клетками т. е. вмести с хромосомой по одной копии получают дочерние клетки. В такую базовую мини плазмиду добавляется определенный набор фрагментов которые облегчают клонирование. Практически всегда это lacZ с промоторами которые позволяют сделать транскрипцию, с удобными сайтами для клонирования, некоторых случаях добавляется сайт для рекомбинации. Версий этих векторов достаточно много. Один из них показан здесь (СМ СЛАЙД 4.13). Ну когда мы разобрались с тем как делаются библиотеки, дальше идет обычное клонирование. Берется фрагмент ДНК и вставляется и поддерживается в каких-то условиях.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вопрос № 6. Геномы Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe.

Теперь перейдем к эукариотическим организмам.

Давайте сдвинемся  с той точки, на которой мы остановились. Вы помните, что стандартный бактериальный  геном это 5 млн. нуклеотидных пар и где-то 3000 генов, но встречаются геномы, которые значительно крупнее. Давайте посмотрим, что получается в одноклеточных эукариотических клетках(1ЭК). 1ЭК всегда крупнее чем бактериальные и по нашим стандартным представлениям, кажется, что это более сложно устроенная клетка и соответственно там все должно быть значительно сложнее. Посмотрим так ли это.

Начнем с  дрожжей(РИС)

 

 

 Представители  которых показаны на вот этом  слайде: вверху пивные дрожжи, внизу хлебные дрожжи. Пиво и вино, которое мы с вами пьем, надеюсь вы помните, что делают хлебные дрожжи. Разница между этими 2мя видами дрожжей на самом деле огромная, эволюционная  дистанции по-разному оценивается, от 600млн до миллиардов лет, т.е. это достаточно разные организмы. И те и другие аскомицеты, но предки аскомицетов достаточно сильного добились и эволюция шла  в основном путем редукции генома, т.е. действительно мы с вами видим здесь пример минимального эукариотического генома. И еще 1 важное различие между организмами, это то, как осуществляется размножение. Пивные дрожжи делятся стандартным бинарным делением, они в этом плане очень похожи на бактерии, а Sacchoromyces почкуется, что делает его немножко неудобным для изучения.

Геномный проект хлебных дрожжей  Sacchoromyces cereviseae это самый первый и самый ранний геномный проект эукариотического организма. (РИС)

СЛАЙДА  НЕТ

В последствии  последовательность была опубликована в окончательном виде в  1996году, вернее в 1997, но полный сиквенс сделан в 1996г доступен. На самом деле был  доступен еще раньше, доступ открывался по мере сиквенирования. Интересно, как это все было организовано. Все это секвинирование делалось в самом начале, практически началось ещё в догеномную эру, поэтому шло традиционным методом, с построением генетических карт, с клонированием   в космидных векторах потому,  что никаких других на тот момент не было. Получилось, что значительная часть серьезных лабораторий только этим вот и занималась, что секвинировала дрожжевой геном. Очень уникальный проект, интересно организованный, все делалось с энтузиазмом и достаточно быстро с технологиями, которые били доступны. Значительная часть последовательности, особенно на начальных этапах, делалась даже не на автоматических секвинаторах, а вручную.

Давайте посмотрим, что у нас в геноме дрожжей есть.(РИС)

 

 Сначала  начнем с тех слайдов, которые  показывают некоторые основные  характеристики дрожжевых геномов,  принципиальные отличия от других  геномов, сводная таблица, которая  покажет, мы детально остановимся.  Во-первых, этот слайд показывает принципиальные различия между центромерными областями хлебных и пивных дрожжей. Мне бы хотелось здесь остановится потому, что это достаточно важная вещь. В курсе молекулярной биологии вам могли приводить вот этот вот пример эукариотической цетромеры, действительно такая центромера работает у хлебных дрожжей, но это единственный случай, всего 100 н.п., которых достаточно для нормальной сегрегации хромосом у Sacchor.cer. тут 2 повтора по концам: 1 повтор,   2ой повтор, и АЦ -богатая центральная область, известно какие белки вот здесь связываются с этими повторами, как крепится кинетохор. Но это единственный организм.

Более стандартная  ситуация вот тут показана. Так  организованы центромерные области  у пивных дрожжей и у большинства  других эукариот. Идея центромерных структур заключается в том, что есть определенный набор чисто центромерных повторов, который скорее всего предназначен для прикрепления  к белку кинетохора и затем соответственно микротрубочкам флагеллина. Но  помимо центромерных повторов, вот схема показана, вот они различные центромерные повторы. Помимо центромерных повторов в обязвтельном порядке присутствуют гены  тРНК и малых РНК, вот тут вот они разбросаны в центромерной части генома, плюс присутствуют некоторые повторы. Вот один тип повторов. Помимо повторов, на этой схеме не очень очевидна эта сруктура, центромерная область обычно накапливает огромное количесво мигрирующих генетических элементов. Оказывается, поскольку собственно кодирующих последовательностей здесь относительно мало, это удобная мишень для инсертного (типа «инсерционные повторы») внесения генетических элементов. Как правило инсерта транспозонов не мешает работе повторов потому, что все, что делают эти повторы, это как правило дают участки для связи с белками кинетохора. Если в инсерте нет повторных, то они не  мешают центрамерам. В результате мы получаем достаточно большие размеры, они измеряются десятками тысяч нуклеотидных пар и как правило сотнями тысяч нуклеотидных пар и для высших эукариот эти размеры могут доходить до миллиона или даже больше н.п. А есть примеры организмов, у которых элементы, необходимые для прикрепления веретена деления вообще разбросаны  по всех хромосоме и, в принципе, функциональной центромеры не образуется. Но это другой экстремальный случай, диаметрально противоположный хлебным дрожжам.

Вот это стандартный  вариант, который можно наблюдать  в геноме подавляющего большинства  эукариотических организмов.

Поскольку мы здесь  имеем дело с эукариотическим  геномом, важная характеристика любого эукариотичкского генома это то, что гены в нем являются прерывистыми. (РИС)

 

Здесь вот сразу  можно сказать, что хлебные дрожжи так же являются аномалиями в этом плане еще по 1 признаку. Но пивные дрожжи стандартные достаточно организмы  по этому показателю. Есть гены с достаточным количеством интроном. Геном достаточно компактный и интронов на самом деле не очень много и, если посмотреть на %, то большая часть генома имеет всего 1 интрон. Но по мере увеличения гена количество интронов возрастает и доходит до 6, даже 10-15 встречается.

Интроны имеют  тенденцию группироваться ближе  к началу. Эта таблица показывает реальное расположение интрона и  расчетное, т.е. если 1 интрон по статистическим данным должен располагаться по середине, а  он располагется между первой и второй четвертью, ну и тд для всех интронов характерна такая тенденция быть расположенными ближе к началу. Это вообще является характеристикой организмов с компактными геномами, механизмы которых расположение окончательно не известно.

 При анализе  сходства участков внутри живого генома выявляются достаточно протяженные участки синтении, тут показаны различными цветами, на счет синтении мы с вами уже говорили и я приводил вам слайд с геномом арабидопсиса, тоже самое можно сказать у дрожжей.(РИС)

 

 Разница  в том, что здесь 16хромосом(т.е. их больше), поэтому получается более сложная картинка, и различные участки разбросаны про хромосоме. Тщательный анализ вот этих всех дупликаций показывает, что в ходе эволюции, несмотря на то, что геном чрезвычайно компактный, даже в этом компактном геноме происходили  дупликации, которые потом сопровождались масштабной делецией генов, поэтому картинка такая разбросанная и не такая четкая как у арабидопсиса.

Несмотря на то, что дрожжи являются хорошо изученными организмами, на сегодняшний момент, достаточно свежая картинка(РИС)

 

 только для  70% кодируемых белков можно приписать  какие-то функции. Если помните,  у бактерий порядка трети геномов относилось к тому, что их можно было отнести к метаболизму,т.е. получается меньше 18% генома, т.е. большее количество генов связано с обычным с клеточным циклом, с ростом   и делением клетки, ну а в прочих категориях такой же %.

Здесь мы с вами остановимся более подробно, поскольку  в этой таблице сравнительная  характеристика двух дрожжевых геномов(РИС).

 

 Еще раз  напоминаю, что эволюционная дистанция  между 2мя дрожжами очень очень  большая, однако результат редукции  этих 2х геномов получается очень  схожим по количественным показателям. Ну давайте посмотрим. Размер генома - почти такой же: 13 с небольшим млн н.п. число хромосом отличается, но я обращал ваше внимание, что число хромосом  не показатель, какая разница сколько их, это просто удобства аппарата деления клетки, вот эта очень интересная цифра, которую мне бы хотелось, чтобы вы запомнили : число генов кодирующих белки число геномов около 5 тысяч. Не обращать внимания на разницу между 2 геномами, т.е. это тоже самое количество которое мы наблюдаем в большинстве бактериальных геномов, т.е. по этому показателю дрожжи чуть сложнее бактерий. Вот важная характеристика по которой наблюдается отличие между хлебными и пивными дрожжами. Как я уже говорил на прошлой лекции по S.cerevis. полностью отсутствуют интроны в кодирующей части, небольшой %, сначала 5% насчитали, потом выяснилось, что это не интроны, сейчас 4%  . вот эти интроны располагаются в самом начале гена до начала кодирующей части, т.е. это нетранслируемые участки. Плотность генов относительно одинаковая, т.е. 1 ген на 2,5тыс н.п. Т.е. тут не написан размер генов, но он оказывается   2,2- 2,4 . И вот наконец достаточно важная цифра: до 70% доходит % кодирующей ДНК, т.е. это очень высокий % показателя который больше нигде в эукариотическом геноме не обнаруживается. У пивных дрожжей пониже получается, геном чуть больше, а генов чуть меньше, до 60%. Не надо забывать, что гены тРНК, рРНК они являются также важными, без них клетка не функционирует. И количество повторов в этих генах оно может существенно различаться между группами и даже между сходными организмами 1 группы, ну в частности тРНК (объективно существенно больше) у хлебных дрожжей, рРНК чуть больше, ну мяРНК приблизительно одинаково. Тут  получается сверху еще где-то 500 генов,    0,1 этого числа, которая не кодирует белок, но тем не менее без которых клетка функционировать не может. Ну и вот еще 1 показатель – это количество транспозонов. Тк геном минимальный, здесь небольшое количество транспозонов: 2,4% у хлебных дрожжей, у пивных совсем мало. Помимо полноразмерных транспозонов, в большом количесве по геному разбросаны концевые повторы LTR подобных элементов. Откуда они берутся я надеюсь вы представляете. Есть стандартный ретровирус или ретровирусно подобный транспозон вот схематичным образом можно нарисовать (РИСУНОК НА ДОСКЕ). Для дрожжей это будет ДЕЛЬТА последовательность. Стандартная гомологичная рекомбинация между этими повторами. Удаляет центральный участок ретротранспазона, остается один LTR повтор вот такой прцесс дрожжевых геномов идет очень эффективно, т.к. чрезвычайно эффективно работает система гомологичной рекомбинации. Допустим если для бактерии для нормальной рекомбинации обычно нужно не меньше 1000  нуклеотидов абсолютно негомологичных, то для дрожжей хватает несколько десятков и уже идет достаточно эффективная рекомбинация, здесь пару сотен получается эти повторы, поэтому очень быстро идет рекомбинация за чет просто рекомбинантов, остается 1-2 последовательности,  и вот то, что мы видим несколько сотен последовательностей они сохраняются. Еще раз обращаю внимание, что кол-во генов такое же как у бактерий, геном получается чуть больше и на самом деле организмы чуть сложнее, это все потому-то гены в 2 раза крупнее, чем бактериальные. Но если по числу функциональных единиц, то получается тоже самое. Из этого следует, что эукариотический способ организации клетки не на много сложнее, чем бактериальный, просто добавляется то, что кодирует оболочку, систему транспорта плюс ядро, а так клетка принципиально не сложнее стандартной бактериальной.