Шпаргалка по "Геномике"

Эта схема пытается оценить во времени последовательность событий, но здесь возможна не совсем точная оценка, т. к. это достаточно сложно. Дивергенция глобина происходила более млрд лет тому назад.

Что из себя представляет стандартный псевдоген? Понятие  псевдоген подразумевает копию, которая имеет очень высокое сходство с функциональным геном, но отличается от него небольшим числом мутаций, которые инактивируют его. Какой это тип мутаций может быть? Вот они все показаны. Для того, чтобы ген функционировал нужен промотор, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, не должно быть стоп-кодонов в экзонной последовательности. Это один из генов глобина кролика, псевдоген, здесь накоплены все варианты замен, которые возможны. Во-первых, вот мутация, которая инактивирует промотор,  во-вторых, есть нонсенс-мутация в экзонной последовательности, в-третьих, уже накопились замены в сайтах сплайсинга. То есть, этот ген уже не совсем подходит под определение псевдогена - мутаций здесь пару десятков.  Другие псевдогены могут отличаться значительно меньшим количеством мутаций. Любая из этих мутаций ген выключает и делает его псевдогеном. Единственная разница может заключаться в том, что, если поменяются сайты сплайсинга, то есть небольшая вероятность появления функционального гена.

Еще один слайд, на который мне хотелось бы обратить ваше внимание. Сегодня я уже вкратце говорил о скорости эволюции кодирующих и некодирующих последовательностей. Если посчитать частоты нуклеотидных замен в первой, второй и третьей позициях кодирующей последовательности, то окажется, что в третьей позиции частота замены значительно выше.

Здесь представлена скорость накопления замен в значимых сайтах и в молчащих. В молчащих сайтах скорость гораздо выше и именно поэтому некодирующие последовательности очень быстро дивергируют. И мы можем четко сравнивать только кодирующие участки.

На этом мы более-менее  заканчиваем про дуплицированные  гены. Хочу заострить внимание, что  механизм дупликации это, как правило, неравный кроссинговер. Почему он вообще возможен? На самом деле, большая  часть вариантов неравного кроссинговера – это законная рекомбинация. Для того, чтобы законным образом произошла неправильная рекомбинация необходимо чтобы в рекомбинирующих хромосомах присутствовали идентичные участки. Если по хромосоме разбросаны любые повторы (протяженностью пару сотен нуклеотидных пар) и если они расположены правильно, то между ними может происходить рекомбинация и её результатом будет дупликация в одной рекомбинировавшей хроматиде и делеция в другой. Мы получаем сразу два эволюционных события – утраченный ген и дуплицированный ген.

Неравный кроссиговер  между разными хромосомами- результат  тот же самый. Между сестринскими хроматидами тоже может произойти  неравный обмен, результат тот же самый.

Большая часть  повторов в длину представляет собой часть мгэ. Хочу сразу заострить ваше внимание: кажется, что  большая часть мгэ это мусор, но он не так бесполезен, как кажется, потому что он делает возможными эти события. А эти события – двигатель эволюции. В эволюции виды утрачивают приспособленность и будут элиминироваться. На самом деле, все эти повторы во многих случаях оказываются весьма полезны.

Просто для  общего развития. Обратная сторона  дупликации – это делеция. Происходит, как правило, одновременно. И то, что эти процессы происходят даже сейчас в человеческой популяции, очень хорошо показывают изученные случаи талассемии, когда у пациента оказываются дефектные глобины. Вот изученный набор делеций, который является причиной этих талассемий, оказывается что все они так или иначе связаны с утратой копии гена в глобиновом кластере, как правило не одной, а нескольких копий. Такие пациенты более-менее здоровы, потому что у них есть вторая функциональная копия (у человека диплоидный организм), но всё равно получается частичный дефект, потому что меньше этих глобинов. У пациентов присутствует анемия.

Теперь мы начинаем говорить о различных типах повторов.

Это тот тип  повторов, который обязательно присутствует у всех типов организмов без исключения и абсолютно необходим для  нормального существования – это повторы рибосомной РНК. Рибосомных РНК должно быть много, чтобы обеспечить достаточное количество рибосом. И организованы повторы рибосомных РНК немножко по разному.

Здесь показаны повторы в эукариотическом геноме, так выглядит транскрипция генов  рибосомных РНК.

Вот видно начало гена, транскрипт становится все длиннее  и вот здесь заканчивается. Потом  идет тоже самое. Вот здесь меченная нуклеиновая кислота и четко  видно как в одном направлении  идет транскрипция одинаковых по размеру  генов. Число копий генов рибосомной РНК в таких тандемных повторах может достигать несколько сотен и даже тысяч. Это все действительно необходимо, чтобы обеспечить нормальный эффективный процесс.

Структура каждого  из этих генов показано вот здесь. Это крупные достаточно гены, их продуктами являются 45 S транскрипты рРНК, потом идет процессинг.

У прокариот  ситуация немножко другая – нет  тандемных повторов, но у них всё  равно должно быть много копий  генов рРНК, они просто по другому  организованы. В данном случае есть вот такой оперон, в его состав входят гены 16 S, 23 S, 5 S рРНК. Тут одна РНК остается за пределами этого кластера. Обычно в прокариотическом кластере присутствует один или несколько генов тРНК , располагается либо между 16 S и 23 S, либо после 5 S. Хромосома любой бактерии содержит несколько копий таких оперонов, у E. Coli - 7. Копии обычно отличаются по генам тРНК – они могут присутствовать, могут отсутствовать.  Но последовательность получается одинаковая. Несколько промоторов в начале, несколько терминаторов в конце, они нужны чтобы гарантировано выключать транскрипты, потому что промоторы сильные.

Другие типы повторов, которые обязательно присутствуют в геноме имеют меньший размер – несколько нуклеотидов или  несколько десятков – микросателлиты и минисателлиты. Берутся они за счет неравного кроссинговера, каждый акт кроссинговера меняет количество повторов на рекомбинирующих молекулах. Этот процесс идет случайно и в разные стороны, таким образом можно получить и больше повторов и меньше повторов. Обычно речь идет о том, что если есть минисателлитный локус, то он будет менее стабильный, чем неповторяющиеся участки генома, за счет вот этих рекомбинационных событий будет меняться количество повторов и их используют в качестве маркера при картировании генома. Такая сателлитная ДНК очень часто занимает значительную часть генома, причем в том случае, когда нуклеотидный состав вот этих небольших повторов существенно отличается от нуклеотидного состава основного генома, такое состояние ДНК можно даже выделить в градиенте плотности хлористого цезия, поскольку она отличается по плавучести. Количество сателлитной ДНК может достигать огромного значения. Хорошо изучены свойства у членистоногих и у риса – до 40% и больше.

Любые  варианты которые также могут отслеживаться  это минисателлиты, размеры у них до 25 н.п. Здесь немного другой механизм их появления, но тем не менее тоже известен достаточно хорошо, также аллели  в популяции присутствуют, синоним для этого типа повторов – VNTR. Они могут быть использованы в качестве молекулярных маркеров. Микросателлитные локусы используются для экспортизации сортов растений, как маркеры в селекции. Это очень удобно т.к. если мы знаем где локус расположен, подобрав пару праймеров слева и справа этого локуса и прогнав ПЦР, мы получаем фрагменты которые в зависимости от размера локуса подвергаются либо агарозному либо полиамидному электрофорезу. При использовании полиакриламидного электрофореза берутся, как правило, микросателлитные локусы.

У дрозофилы  три типа повторов, которые отличаются на несколько букв, очевидно что все эти повторы имеют одно происхождение. Несмотря на то, что повторы короткие они занимают много места в геноме.

В геноме позвоночных  так же имеются сателлитные повторы. У человека основной повтор – это Alu последовательность (около 300 н.п.). у мыши в таком же повторе более четко прослеживается симметрия и можно проследить, откуда он взялся. Если разделить пополам стандартный повтор мыши, то видно что две половинки похожи. Если их потом опять разрезать пополам и сложить, то прослеживается четкая симметрия между четвертинками. И осьмушки этого повтора симметричны. Видно, что вот эта исходная последовательность сначала дуплицировалась, потом опять дуплицировалась и ещё раз, три дупликации произошло. Немножко дивергировали части. В конкретном организме могут быть любые варианты – либо относительно короткий повтор как у членистоногих, либо длиннее, либо несколько сотен нуклеотидных пар, как у позвоночных.

Механизм возникновения  повторов – проскальзывание РНК-полимеразы во время репликации. Вот показано, как это происходит. Вот повтор и когда идет репликация, когда реплицировано уже пару таких последовательностей, одна из этих цепочек может образовать петлю и подвинуться на шажок назад, на один или несколько повторов. Если репликация после этого повторяется, то мы получаем два лишних повтора. Если такой же произойдет в матричной цепи, а это равновероятный процесс, то у нас будет не дупликация, а делеция. Таким образом, меняется размер микросателлита даже в результате кроссинговера.

Вопрос № 10. Сравнительный анализ геномов органелл и родственных бактерий. Доказательство симбиотического происхождения органелл.

Ещё один факт, который касается эволюции геномов. Вы не должны забывать, что эукариотические клетки – это результат многократного эндосимбиоза. Классическая теория симбиогенеза: сначала была примитивная анаэробная эукариотическая клетка, затем в результате симбиоза с альфапротобактериями эта клетка получила возможность детоксицировать кислород (то есть первичный смысл симбиоза – ингибировать токсичное соединение), потом митохондрии стали уже облигатными компонентами клетка и клетка научилась извлекать дополнительную выгоду из них. Второй этап эндосимбиоза – это для растений – точно таким же образом в клетке появились хлоропласты. Кстати, различные варианты эндосимбиоза потом ещё проходили многократно, в частности, простейшие одноклеточные (водоросли) имеют очень хитрый хлоропласт – на самом деле это симбионт – эукариотическая водоросль с максимально редуцированным геномом.

Вы представляете, что каждый из этих эндосимбионтов имеет свой геном. Если посмотреть на эту ситуацию: вот у нас прокариотическая аэробная бактерия и анаэробная эукариотическая клетка. Возможно, что в те далекие времена они имели одинаковые размеры. Сначала в одной клетке собрались два примерно равноценных генома, но это неудобно поддерживать в клетке два набора ДНК одновременно, потому что надо обеспечивать правильную сегрегацию между дочерними клетками. Постепенно происходила миграция фрагментов генома эндосимбионтов в ядерный геном. То что мы имеем сейчас в эукариотической клетке – это фактически гибридный геном, в котором соединились черты примитивной эукариотической анаэробной клетки и бактериальных эндосимбионтов.

Я надеюсь я  не забыл сказать о симбиотическом происхождении эукариотических геномов. И вот у нас здесь геном бактерии, и того что сейчас есть в геноме эукариот., ну собственно геномы органеллы эукариотической  Четко показывает что да, действительно эта  гипотеза эмбриогенеза, она имеет четкое материальное обоснование. И в частности анализ митохондриальных геномов позволяет выяснить наиболее близкие представители бактерий, который сейчас скорее всего находятся в той же таксономическо  группе как и древние предшественники митохондиральных ДНК.

 Значит такой бактерией сейчас является Rickettsia.

Ну Rickettsia если точнее говорить, бактерия возбудитель тифа, аблигатный паразит, от облигатного паразитизма один шаг до облигатного эндосимбиоза.

На чем основоны вот эти построения о происхождении  митохондрий от какой-то примитивной бактерии.

Вот один из слайдов  который покажет эти сходства.(РИС)

Если проанализировать белки которые кодируют митохондрии, митохондриальный геном и геном  клетки, то окажется что достаточно высокая степень сходства наблюдается, и что особенно важно собственно в каких функциональных категориях находятся наиболее сложные белки, кодируемые геномом. В категориях которые занимаются энергентическим метаболизмам и кактегории которые связаны с транспортом. Больше всего генов попадает в эти категории. Сходство  получается нее очень высоким, но именно эти гены сохраняются в геномах органелл в первую очередь это показывает ради чего органеллы здесь присутствуют.

Если посмотреть на организацию соответствующего генома

то тут прослеживается также достаточно серьезные сходства, но времени прошло уже очень мгного, и сходство ограничено спецефическими учасками, ну в частности. Если проанализировать более консервативные вещи, это гены, которые кодируют рибосомные белки, гены РНК-полимеразы, субъединиц, опять рибосомные белки, факторы элонгации. То есть фот стандартный кластер генов, которые  располагаются в митохондриальной ДНК и практически в таком же порядке они располагаются в Rickettsia только есть небольшая реорганизация, т.е. вот это вот часть и вот эта поменялись местами, вот эта чачть переместилась в другую!!!, но в общем сходство последовательностей.

 Если посмотреть  на это немножко по-другому,  то так же прослеживается приблизительно  такое же раположение по геному, т.е. это не уникальные участки  гомологии……………. Сохраняются(7.44) . Естественно что сходство полностью не распространяется  на  весь геном, но его достаточно, чтобы предполагать какое-то общее происхождение.

Если немножко подумать о биологии Rickettsia, то это уникальная бактерия, уникальный паразит, который является энергетическим паразитом. Т.е. это наиболее специализированный, наиболее продвинутый паразит, который не тырит у хозяина какие-то сахара, аминокислоты, а идет гораздо дальше, крадет у него прямо АТФ. РИК имеет помпу, которая закачивает АТФ в бактериальную клетку. От этого один шаг, от изменения направления работы этой помпы, получается, мембранный транспортер который транспортирует АТФ наружу.  Так вот все что нужно было получить митохондриям, это перевернуть направление работы мембранного транспортера и мы уже получаем митохондрии, которые синтезируют АТФ внутри и транспортируют его наружу. Т.е. это достаточно простое изменение  и вполне возможно что предковая и форма бактерии…еще самомтоятельно генерировала  АТФ в больших количествах и не требовала изменений.