Шпаргалка по "Геномике"

С хлоропластами  таже самая история. Сравнения с  геномами цианобактерий четко показывает общность происхождения. Т.е. только сейчас есть хлоропластная ДНК, ну попала в эукариотическую клетку в составе генома экто-симбионта( функцию бактерий. Ну и не надо забывать о функциях(способах?) переноса материала из генома органелл в ядерный геном. Значительная часть того, что раньше было в геноме эндосимбионта сейчас находится в ядре, поэтому вас не должно вводить в заблуждение то, что некоторые митохондриальные геномы они имеют место в некоторых других десятках  генов. Все прочие гены необходимы для функционирования этого относительно автономного объекта внутри эукариотической клетке они присутствуют. …

По различным  оценкам, количесво мигрирующихх    в ядро генов  где-то 4 процента  составляют, и т.обр., полная структура митохондрий составляет не менее 500 белков, ну в хлоропластах еще больше получается.

Вопрос  № 11. Классификация, строение, основные свойства и распространение мобильных генетических элементов эукариот.

Эукариотические транспозоны

 

У эукариот есть такого же типа как  и у бактерий транспозоны-  ДНК-транспозоны и перемещение такое же. Но чаше консервативный мех-зм.

Интересно то, что  для ДНК эукариот характерно присутствие  нескольких версий ДНК-транспозонов. Несколько  семейств в состав каждого входят :

1. полноразмерный транспозон, который может сам перемещаться., его называют автономным .
2. делеционные варианты, которые наз-т неавтономные- сами перемещаться не могут, но т.к. это делеционный вариант того же самого транспозона, то транспозаза распознает их концы- инвертированные повторы – и обеспечивает их перемещение.

на примере  кукурузы показаны семейства таких  транспозонов.

1 сем-во: Б.МакКлинток  активатор- полноразмерный транспозон  и диссоциатор- его эволюционная  производная.

2 сем-во: Spm( это полноразмерный транспозон) и dSpm( делецион вариант Spm). Энхансер и ингибитор очень похож

 

Вверху показана система  активатора. Относительно небольшой  для эукариот  МГЭ, на концах инвертированные повторы  внутри одна рамка считывания, разбитая на 5 экзонов. Все эти  5 экзонов должны присутствовать, чтобы получалась полноразмерная транспозаза. Неавтономные производные имеют варианты делеции, которые затрагивают один или несколько экзонов. Сколько экзонов затронуты неважно, т.к. делеция одного из них выключает транспозазу и делает фермент неактивным.

В других семействай происходит тоже самое: Spm-элемент на слайде 4.55 Он немного по-другому выглядит, у него есть достаточно протяженный ген транспозазы ( 10 т.н.п.), 11 экзонов. Между 1 и 2 очень крупный интрон и в середине этого интрона 2 рамки считывания, которые учавствуют в транспозиции.

Следовательно есть 2 типа делеционной производной (снизу)

1. делеционные производные, которые затрагивают Spm w- элементы
2. полноценные dSpm-элементы, элементы, которые затрагивают несколько миллионов транспозазы. Т.е. W-затрагивает вспомогательные рамки считывания,а просто dSpm-элементы затрагивают экзоны транспозазы. Вспомогательные рамки считывания повышают эффективность транспозиции, но не абсолютно обходимы.

 На примере  этих  элементов хочется уточнить какова  делеционная судьба ДНК-транспозонов в геноме любого эукариотического организма:

В какой-то момент времени этот полноразмерный автономный транспозон  впервые появляется в этом геноме( есть несколько мех-мов  внедрениятранспозонов, разбирать их не будем), но после их появления геном начинает быстро проявляться геном, копий 50-100 транспозонов сразу появляется и с течением времени появляютя делеционные транспозоныи получаются интересные картины:

- из такого  делеционного варианта может получиться тоже делеционный вариант, только длиннее. Но любой делеционный вариант является субстратом для транспозазы. С течение времени накапливается больше экзонов –произвольных транспозонов, а функциональных копий становится меньше, потому что чум короче транспозон тем более эффективно его перемещение,т.е. чем ближе концы , тем легче связывается транспозаза, тем эффективнее будет перемещение.

Когда появляется делеционная  производная, то они скачут чаще, чем  полноразмерная  исходная копия  МГЭ. Заканчивается все это тем, что в какой-то момент времени последняя функциональная копия выключается за счет делеции и в результате все делеционные производные не имеют трансозазового перемещения и сем-во транспозонов вымерает. (хотя они еще долго детектируют в геноме, т.к процессы делеции идут медленно в эукариотич геноме)в нашем геноме нет ни одного активного транспозона!

За счет таких активных делеционных механизмов ДНК-транспозоны  в эукариотич геноме не очень эффективны.  Этому мешает наличие ядерной  оболочки.

 

 

 

 

Варианты транспозонов на слайде. Транспозоны дрозофилы melanogaster.

Нас интересует  Р-элемент, кот-й хорошо изучен и присутствует в большинстве. Кроме Р-элементов, есть элементы с длинными инвертированными повторами, которые оч похожи по структуре  на состовные транспозоны прокариот  и скорее всего таковыми являются. И есть ретро-транспозоны, у которых на концах прямые повторы.

СЛАЙД   4.57 Р-элементы- определяет момент гибридного дисгенеза у дрозофилы.

 

Суть гибридного дисгенеза: при скрещивании определенных линий  дрозофил получаются разные варианты, в зависимости от того из какой линии берется материнский и отцовский продукты.  Если мать, несет Р-линию, то получается  стерильный гибрид, который не дают потомство. Если с Р-линией отец, то получается фертильный гибрид, который дает нормальное потомство.

Что это за Р-элемент? Стандартный ДНК-транспозон, содержащий 4 экзона, на концах инвертируемые повторы. В результате транскрипции образуются несколько вариантов транскриптов. Во-первых, разница заключается в местах, где происходит полиаденилирование, но от этого пренципиально ничего не меняется, (т.к.и тот и другой транскрипт дают транспозазу)

Но во время сплайсинга возможны варианта, когда 3-ий интрон остается или вырезается. Если он остается, то у него присутствует стор-кодон и  при трансляции заканчивается перед  последним экзоном, который не транслируется. Если же интрон вырезается, то получается нормальная мРНК, полня рамка считывания и транспозаза досчитывается до конца и получаетсч функциональный белок.(фактически этот белок является репрессором). Такой вариант сплайсенга происходит в соматич кл, поэтому репрессор есть. В генерат-х кл репрессора нет и там синтезируется полноразмерная транспозаза и р-элемент в генерать кл-х очень активно способен перемещаться.

Рассмотрим варианты скрещивания  и что при этом происходит СЛАЙД 

Если у нас в качестве отцовской и материнской линии  выступают мухи с Р-элементом, то получаются нормальные фертильные гибриды, т.к репрессор присутствует и  никаких проблем нет.

Если у нас в качестве отца выступает муха из р-линии, то получаетсч интересная ситуация: в сперматозоиде практически нет цитоплазмы, поэтому репрессор там присутствовать не может, и при слиянии гамет получается зигота ,  в которой начисто отсутствует репрессор Р-элемента. Соответственно,  когда начинается дробление и получаютя клетки генеративной линии, то в них происходит масштабное транспозиция Р-элемента, он с высокой вероятностью выключает жизненно важные гены и в результате получается стерильная муха. Она фенотипически нормальная, т.к. в соматич клетках транспозиция не идет, а в генерат идет и-за отсутствия репрессора. При  рецепроктном скрещивании( наоборот) в яйцекл много репрессора и гибридный дисгенез не развивается.

  Ретротранспозоны- это важный класс МГЭ у эукариот, нет у прокариот. У эукариот эти МГЭ достаточно успешные, и размножаютя в такой степени, что занимают значительную часть генома, в частности и у человека. Большая часть генома чел-ка занята нетранслируемыми транспозонами.

Есть несколько семейств ретротранспозонов и можно спорить  о том, какого они происхождения-первое. Второе- ретротранспозоны имеют общее происхождение с ретровирусами. Тут  есть варианты: либо ретротранспозоны рассматриваются как делеционные варианты ретровируса и такие транспозоны есть., либо ретровирусы произошли от ретротранспозонов, приобретя белки оболочки.

Мех-зм перемещения реттротранспозонов 

Классический ретровирус. При заражении клетки его ДНК  попадает в клетку, идет синтез кДНК копии, она делается двуцепочечной, и такая ДНК ретровируса встраивается в геномную ДНК клетки, затем идет транскрипция этой РНК, синтез белков, упаковка вирусных частиц и цикл инфекции повторяется. Если у ретровируса убрать стадию упаковки(за счет делеции генов капсида и гена оболочки), то он не сможет покинуть клетку, но будет обладать способностью перемещатьвнутри геном а той же самой клетки. Т.к. этот продукт кодирует  ферменты, которые необходимы  для  синтеза кДНК копий и для интеграции генома бактериального. Соответственно часть ретротранспозонов похожи на ретровирусы.

На СЛАЙДЕ  представлены семейства ретротранспозоны эукариотич клетки . первые из них это очевидные родственники ретровирусов. Более интересное второе сем-во- неретровирусные ретротранспозоны. неретровирусные транспозоны дел на 2 сем-ва: автономных(LINE, длинные) и неавтономных(SINE, короткие).  Они не имеют общего с 1 се-вом , кроме фермента обратной транскриптазой(на строчке ферментативная активность), кот-я обеспечивает синтез ДНК на РНК матрице и то, что при интеграции в геном образуются прямые повторы на том месте, где транспозон встраивается. Это хар-но для любых МГЭ, т.к. они режутся ступенчато.

Отличия между этими транспозонами, 1. у ретровирусов длинные концевые повторы, а неретровирусные нет повторов. Т.е. единственный класс без повторов.

2. вспомогат ферменты, которые  учавствуют в перемещении. У ретровирусов- это интеграза ( по сути это та же транспозаза по структуре, по мех-му действия). У неретровирусов- нуклеаза-с его действия начинается процесс перемещения

Интеграция провируса  в геном клетки

 

Представлена  структура полноразмерного ретровируса ( ретровирусоподобные транспозоны – это делеционный вариант,т.е. нельзя сказать, что раньше: ретровирусы или транспозоны) сейчас это выглядит как укороченная копия полноразмерных элементов.  В состав стандартного ретровируса входят 3 гена: gag, pol,Env. По концам длинные повторы. Они укорочены в геноме, но при репликации полностью достраиваются. Т.е полный размер будет U3, R,U5. В геномной ДНК не хватает R и И35. В момент интеграции повторы достраиваются полностью. Все, что нужно для перемещения кодирует ген полимераза- он кодирует и обратную полимеразу и транскриптазу.  Две другие рамки нужны вирусу: Gag кодирует белки, которые учавствуют в упаковке ДНК,т.е. формирует вирусный нуклеоид.  Env кодируют белки оболочки.

Интересно то, что  промотор, с которого идет транскрипция располагается в левом повторе и с него полностью транскрибируется полноразмерная матричная РНК ретровируса. С этой матричной РНК хорошо транслируется только первая рамка, которая соответствует  Gag гену.  Pol и Env находятся со сдвигом рамки считывания.

Поэтому, чтобы  получить результат процесса 2 и 3-его  гена нужно рамку сдвинуть. Два  возможных варианта: либо супрессия  стоп-годона посде первого гена, либо сдвиг рамки. В результате в 5% случаев трансляция идет дальше и  получается белковая после-ть. Каждые из этих белков за счет протеолиза ращепляются до пептидов, которые выполняют дальнейшие функции .Gag  ген и Pol ген разрезается и функции ниже. В паре перемещения нас интересует обратная транскриптаза и интеграза.

  СЛАЙД 4.63  Если рассмотреть что происходит с транспозонами, то получается следующее: у нас схема станд ретровируса, имеются длинные концевые повторы одинаковой ориентации. Два классических примера- это дрожжевой и 42.52 ретротранспозон. У дрожжей Ту-элементы, их несколько штук (ту1,2,3,4,5) и это классич ретровирус, имеются повторы по концам и 2 гена ТуА гомологичен Gag гену и ТуВ гомологичен роl гену. Сверху показаны участки, которые схожи с полимеразой, интегразой и с gag белком

 

 

Слайд 4.64-4.65

 В 

 

 

 

неретровирусоподобном элементе единственный участок сходства- это ген обратной транскриптазы, а так больше ничего нет.

Что происходит в клетке, если попадает геномная РНК ретровируса( когда начинается процесс перемещения  ретротранспозонов). Если речь идет о  ретротранспозоне, то просто идет транскрипция его РНК, эквивалентная РНК ретровируса. Затем нужно получить ДНК копию геномной РНК. Обычно в качестве затравки выступ тРНК, которая покуется в вирусную головку. В случае транспозона, то они просто присутствуют в клетке. тРНК спаривается с левым повтором и с использованием тРНК в качестве затравки синтезиреются  копия  левого повтора. Затем получается интересное событие. Нужно просинтезировать вот эту копию. Как это происходит. Обратная транскриптазаза засчет своей экзонуклеазной активности подрезает матричную цепь ДНК, после большого укорочения эта ДНК копия может спариваться с другим повтором, причем синтезированный участок ДНК может отсоединиться от матрицы и присоединится к ней с другой стороны, либо спариваться с другой копией геномной РНК ретровируса. Большинство ретровирусов сод-т 2 молекулы РНК в капсиде. Так или иначе получаем спаривание этого повтора с левым концом и тогда идет репликация этого конца, в результате получаем целиком полную цепь с транспозонами. Если посмотреть, то есть полноценный повтор на конце U3,U5,R- все 3 элемента концевого повтора. После того, как получили первую цепочку, должна получиться вторая. Чтобы вторая цепь получилась надо убрать РНК. Затем с помощью РНКзной  активности удаляется большая часть матричной РНК, но фрагменты остаются. Эти фрагменты используются в качестве затравки и обратная транскриптаза синтезирует вторую цепочку РНК. Мы получаем копию одного конца и опять должна произойти смена матрицы( этот фрагмент должен отсоединится и спариться с другим повтором). После спаривания просинтезируется до конца  и в конце получаем полноразмерную геномную ДНК с двумя функциональными копиями повторов по двум концам.