Дифференциально-термический анализ и дифференциальная сканирующая калориметрия

Следующим этапом является нахождение кривой избыточного теплопоглощения, которая  отражает только денатурационное поглощение тепла образцом, отбрасывая информацию о температурных зависимостях теплоёмкости нативного и денатурированного состояний. Для этого из термограммы вычитают её базовую линию (панель Б рисунка точечная линия). Как нативный, так и денатурированный белок имеют почти линейные зависимости теплоёмкости от температуры (участки до и после пика). Очевидно, что в области пика теплопоглощения присутствуют одновременно обе формы белка, причём при температуре, соответствующей максимуму пика, число денатурированных и нативных молекул одинаково, поэтому на температурном интервале пика его базовая линия вычисляется, учитывая пропорциональный вклад каждого из состояний в теплоёмкость. На панели Б рисунка базовая линия изображена в виде точечной сигмоидальной линии, соединяющей температурные зависимости теплоёмкости нативного и денатурированного состояний. После вычета базовой линии мы получаем кривую избыточной парциальной теплоёмкости, (панель В рисунка). Анализ этой зависимости достаточно сложен и требует в различных случаях применения целого ряда математических моделей. Описание наиболее общих моделей для анализа кривых избыточной парциальной теплоёмкости приведено ниже.

Мультидоменные белки

 Описанные выше  методы анализа термодинамических  данных, полученных с помощью  ДСК, справедливы лишь для небольших  глобулярных белков, денатурация  которых проходит по схеме  "всё или ничего". Однако, большинство известных белков представляют собой крупные мультидоменные комплексы и поэтому не могут быть представлены как одиночные кооперативные единицы и их денатурация не является простым одностадийным переходом. Домены в таких "молекулярных машинах" зачастую являются биологически функциональными единицами, а их взаимодействие обеспечивает внутримолекулярную коммуникацию и координирует их действия. Дискретизация структуры, полученная с помощью данных ЯМР или рентгеноструктурного анализа, может существенным образом отличаться от таковой, определённой методом ДСК. В самом деле, встречаются случаи, когда белок с чётко выраженным разделением на структурные домены представляет единую кооперативную единицу, и, наоборот, единая структура при определённых условиях может плавиться в несколько этапов. Это происходит из-за того, что структурные данные дают нам информацию лишь о взаимном расположении элементов составляющих белок, не учитывая при этом энергетику их взаимодействий. Калориметрия же, напротив, даёт нам интегральные характеристики кооперативных единиц белка, основанные на различии в их термодинамических свойствах. Основное свойство кооперативной единицы заключается в том, что её элементы могут изменить своё состояние только коллективно, поэтому домен* сворачивается и разворачивается по принципу "всё или ничего", а различия в термодинамических свойствах доменов, о которых говорилось выше, приводят к тому, что при повышении температуры их нативная структура распадается независимо. Последнее означает то, что при денатурации белок проходит несколько промежуточных состояний. Это отражается на температурной зависимости парциальной теплоёмкости как суперпозиция нескольких (часто перекрывающихся) пиков теплопоглощения, соответствующих разворачиванию отдельных доменов. Такие термограммы часто интерпретируются как сумма независимых одностадийных переходов. Справедливость такого допущения обычно проверяется сравнением термограмм нескольких фрагментов изучаемого белка, полученных тем или иным способом, с кривой плавления целого белка. Долгое время из кривых теплопоглощения мультидоменных белков удавалось извлекать весьма ограниченную информацию. Однако, в 1978 году Фрейер и Билтонен предложили рекурсивный пошаговый алгоритм определения числа и термодинамических характеристик промежуточных состояний, белков, домены которых денатурируют равновесно, обратимо и независимо, опирающийся на некоторые фундаментальные свойства калориметрических кривых. Тем не менее, для решения практических задач этот алгоритм требовал улучшений, которые были сделаны Филимоновым с соавторами в 1982 году. При наличии сильных междоменных взаимодействий вид термограммы может существенно меняться в зависимости от характера этих взаимодействий, и стандартные алгоритмы анализа перестают работать. К сожалению, общего алгоритма анализа таких калориметрических кривых не разработано, и в этих случаях анализ термограмм необходимо проводить, исходя из той или иной теоретической модели, по возможности дополняя данные экспериментами с фрагментами молекулы изучаемого образца. Лишь для белков, состоящих из двух доменов, в 1989 году Брандсом была разработана модель, учитывающая их взаимодействие.

Приборная база

Первые дифференциальные калориметры, появившиеся в середине шестидесятых годов, обладали чувствительностью  на три порядка выше, чем у абсолютных калориметров, существовавших к тому времени. Такое существенной увеличение чувствительности было достигнуто за счёт использования наряду с дифференциальной схемой измерений непрерывного нагрева  и полной адиабатичности ячеек. Важным шагом стало применение неизвлекаемых ячеек, что позволило повысить точность получаемых результатов за счёт увеличения воспроизводимости их заполнения. Материалами для ячеек служат платина, золото, сплавы тантала и стекло. Дальнейшее усовершенствование было достигнуто путём использования капиллярных спиральных калориметрических ячеек, которые позволили снизить температурный градиент в ячейках, существенно упростить их заполнение и избежать тем самым появления в ячейке пузырьков, которые вносят существенную ошибку в измерение теплоёмкости. Кроме того, стало возможным увеличить избыточное давление, подводимое к ячейкам, и тем самым расширить температурный интервал измерений до 130°C. Представителями калориметров с капиллярными ячейками являются ДАСМ-4, MicroСal-2 и Nano-DSC, производимые Российской Академией Наук (НПО "Биоприбор", Пущино), фирмой MicroCal (США) и Calorimetry Sciences Corporation (США), соответственно.

На рисунке изображена схема современного сканирующего микрокалориметра. Две идентичные ячейки, изолированные  от окружающей среды с помощью  адиабатической оболочки, прогреваются с постоянной скоростью. При этом одна из ячеек заполнена растворителем, а другая раствором белка. Мощности электронагревателей обеих ячеек  автоматически регулируются с помощью "Регулятора нагрева 1 и 2" так, чтобы  выдержать заданную скорость нагрева, при этом основная энергия идёт на нагрев растворов в ячейках. Однако, часть этой энергии расходуется  на нагрев и плавление в одной  из ячеек исследуемого белка. Из-за этого, для поддержания одинаковой температуры в ячейках и сохранения одинаковой скорости их прогрева, мощности, подводимые к ячейкам различны. Эта  разность мощностей регистрируется с помощью компьютера или самописца  в виде функции от температуры. Таким  образом, происходит сканирование по температурной  шкале с непрерывной регистрацией теплового разбаланса ячеек, возникающего из-за дополнительных тепловых затрат требующихся для нагрева и плавления исследуемого белка. Требования к чистоте и гомогенности образцов в микрокалориметрических экспериментах достаточно высокие. Необходимая для измерений концентрация изучаемого вещества зависит от характерных особенностей его структуры и, как правило, для белков составляет 0,1-1,0 мг/мл при скорости сканирования 1 К/мин.

Литература

1. Корзанов В.С., Котомцева М.Г., Юнусов Р.И. Термогравиметрия;
2. Аносов В. Я., Озерова М. И., Фиалков Ю. Я., Основы физико-химического анализа, М., 1976;
3. Егунов В. П. Введение в термический анализ: монография — Самара, 1996. — 270 с.
4. Цветков Филипп, Термодинамический анализ структуры кальций-связывающих белков.

1998-2002; Институт  Молекулярной Биологии РАН, Москва, Россия, диссертация на соискание  степени кандидата физ.-мат. наук;

5. http://www.techob.ru