Фитоэстрогены

Ввдение:

В настоящее время особый интерес вызывают некоторые представители класса биофлавоноидов, проявляющие, как показали специальные исследования, гормоноподобные, а именно – эстрогенные свойства и названные поэтому фитоэстрогенами. Хотя высокая биологическая активность лекарственных средств из растений, применяемых в том числе и для коррекции расстройств полового цикла и репродуктивной функции, известна давно, изучение роли фитоэстрогенов в физиологии и патологии репродуктивной системы человека и животных является новой.

Есть данные, что изофлавоны, так же как и эстрогены, влияют на профиль липидов плазмы, снижая риск сердечно-сосудистых заболеваний, а также замедляют развитие остеопороза. Все изофлавоны являются антиоксидантами, то есть могут нейтрализовать свободные радикалы.

Нашей задачей будет обобщение сведений о химической природе фитоэстрогенов, истории их открытия, о методах их анализа, а так же рассмотрение некоторых растений содержащих фитоэстрогены.

Фитоэстрогены (Phytoestrogens)— это разнородная группа природных нестероидных растительных соединений, которые благодаря своей структуре, сходной с эстрадиолом, могут вызывать эстрогенный и (или) антиэстрогенный эффектх[2].

Классификация фитоэстрогенов.

После открытия фитоэстрогенов и проведения, начиная с середины 30-х годов, исследований их структуры и биологического действия все они были разделены на 2 большие группы: изофлавоноиды, соответствующие по структуре гетероциклическим фенолам, и лигнаны, структурно относящиеся к классу дифенолов. В настоящее время все фитоэстрогены можно разделить на шесть основных категорий:

                    куместаны;

                    лактоны резорциловой кислоты;

                    изофлавоны;

                    флавоны;

                    халконы;

                    лигнаны.

Изофлавоны, лигнаны и куместаны  наиболее распространены в природе. Изофлавоны присутствуют в растениях в основном в виде гликозидов, которые легко растворяются в клеточном соке. Основную группу связанных флавонойдов составляют О-гликозиды; в меньшей степени распространены С-гликозиды. О-гликозиды в зависимости от числа остатков сахара, положения и порядка их присоединения делятся на монозиды, биозиды, триозиды, и дикликозидгы. В дигликозидах моносахара присоединяются в двух разных положениях. В качестве сахарных остатков чаще встречаются: из гексоз - глюкоза, галактоза; из пентоз - ксилоза, арабиноза; из метилированных пентоз – рамноза; из уроновых кислот – кислота глюкуроновая. В кишечнике под действием кишечной микрофлоры гликозиды гидролизуются и распадаются на сахаристую часть и несахаристый компонент – агликон, в результате чего образуются соединения с эстрогенной активностью: формононетин, дейдзеин, генистейн, биоканин-А и др. Биоканин-А может метаболизироваться до генистейна, а формононетин – до дейдзеина и эквола, обладающих наибольшей эстрогенной активностью. Основным представителем куместанов является куместрол[2].

Наиболее изученные лигнаны – энтеродиол и энтеролактон являются продуктами осуществляющегося под воздействием микробов кишечника метаболизма их предшественников – секоизоларицирезинола и метайрезинола[2].

            Секоизоларицирезинола

Анализ фитоэстрогенов(изофлавонов)

Изофлавоны являются наиболее распространенными в природе фитоэстрогенами, поэтоиу данные соединения изучены более полно, чем остальные представите фитоэстрогенов[3].

1.2.2.  Physical and Chemical Properties of Isoflavones              Физические и химические свойства изофлавонов

1.2.2.1. Water SolubilityРастворимость в воде:Isoflavones are low molecular weight (MW of daidzein = 254, MW of genistein = Изофлавоны низко молекулярные соединения(Мrдаидзеина = 254, Мr генистеина =270, MW of biochanin A = 284) hydrophobic compounds. 270, Мr biochanin = 284) гидрофобные.В воде растворимыof the isoflavone aglucones are low and due to the acidic nature of the phenolic  мало.groups are pH dependent. The methylated derivatives, biochanin A and formononetin Метилированных производных, биоканин и формононетинare less soluble than genistein and daidzein, respectively. менее растворимы, чем генистеина и даидзеина, соответственно. (Committee on Toxicity ofСопряжение сglucose, glucuronide or sulphate groups increases the solubility (Setchell and глюкозой,глюкуронидом или сульфатной группой увеличивает растворимость[3].

Cassidy, 1999).Выделение Фитоэстрогенов

Isoflavones are often present as glucosides in plants.Изофлавоны часто присутствуют как гликозиды в растениях. Since acidic conditions make В кислоий среде гликозиды гидролизуются до аглтконов. Для извлечения изофлавонов используют кислотный гидролиз.glucosides to deconjugate into aglucones, most extraction procedures involve acid Hydrolysis with 1-2 M hydrochloric acid at 100 ºC or refluxing with acid Гидролиз в 1-2 М соляной кислоте при 100 °С или кипячением с кислотойin the presence of ethanol has been used to form the aglucones (Wilkinson et. al. , в присутствии этанола можно использовать для выделения агликонов. Однако есть некоторые данные о том, что генестеин неустойчив при воздействииhydrolysis conditions (Franke et. al. , 1994; Garrett et. al. , 1999). гдролизом. Современные методы извлечения: включающие сверхкритические флюидные извлечения, ультразвук в сочетании с извлечением под давлениемliquid extraction (accelerated solvent extraction, жидкостной экстракции (ускоренная экстракция растворителем,pressurized под давлениемsolvent extraction), microwave- ), СВЧ- извлечение и твердофазная экстракция[4].

Аналитические методы

Эстрогенная активность красного клевера связана, в основном, с изофлавонами, и в меньшей степени с куместанами. Большинство работ, посвященных данной теме, основано на анализе изофлавонов сои (дейдзеин и генистейн). Это объясняется тем, что до недавнего времени отсутствовала методика, сфокусированная на анализ и оценку изофлавонов экстракта красного клевера. Такой метод был разработан Krenn с соавт. Этот метод позволил определить содержание отдельных изофлавонов в различных экстрактах красного клевера и в препаратах красного клевера. Было определено, что основными изофлавонами являются формононетин и биоканин-А, в то время как генистейн и дейдзеин присутствуют лишь в небольших количествах. А так же доказано, что содержание биоканина А и формононетина зависит от происхождения и сорта красного клевера, и составляет в среднем от 0,025 до 0,3%, концентрация генистейна и дейдзеина составляет около одной десятой от этих значений. Сорта красного клевера с высоким содержанием изофлавонов в настоящее время выводятся искусственно, селекционируются и выращиваются специально для использования в фармацевтическом производстве[4].

В шестидесятые и семидесятые годы для определения изофлавонов в красном клевере были применены  новые методы: хроматография и спектрометрия. В настоящее время для выделения и количественной оценки изофлавонов красного клевера используется метод обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ)[4].

Количественный анализ изофлавонов может бытьperformed with or without a hydrolysis step выполнены с гидролизом или без негоincluded.. For methods without hydrolysis it is Для методов без гидролиза-этоpossible to quantify all glycosides and free возможность количественной оценки всех гликозидов иaglycones present in the sample, but only if an агликонов присутствующих в образце, но тогда точного хроматографического разделения не достигается.In this case the analysis can be more difficult В этом случае анализ может быть более сложным because of the large number of analytes and also из-за большого числа аналитов, а такжеbecause of the stability issues of the glycosides из-за проблем со стабильностью гликозидовduring sample preparation. во время подготовки образца. If the sample treatment Если обработка образцовinvolves hydrolysis (acid hydrolysis) all glycosides включает гидролиз (кислотный гидролиз) все гликозидыare transformed into free aglycones, and accurate преобразуются в свободные агликоны, и точноеquantification is performed more easily. количественное определение проводится более легко. Для сокращения числа анолитов путем гидролизаstep introduced before chromatographic analysis  до хроматографического анализаhad also other reasons. есть и другие причины. Firstly, it eliminates the Во-первых, он устраняетpossible errors due to the instability of the возможные ошибки из-за нестабильностиglycoside forms (acetyl and malonyl derivatives гликозидых формare unstable during sample preparation).. Secondly, Во-вторых, it guarantees accurate quantification of the active она гарантирует точную количественную оценку активной forms of isoflavones (because only the aglycones формы изофлавонов (потому что только агликоны являются фармакологически активными, после приема пищиthe conjugated forms are metabolized to these free сопряженные формы метаболизируются в эти свободныеaglycones). агликоны). Finally, another issue with theНаконец, приquantification of glycosides is the availability of количественном определении гликозидов необходимо наличие reference standards: due to their instability these эталонных стандартов: из-за их неустойчивости этихforms are not widely commercially available. формы не являются широко имеющимися в продаже[9].

The most widely used techniques for measurement of phytoestrogens are :               Наиболее широко используемые методы для количественного определения фитоэстрогенов являются:

• reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) with • обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ) с

ultraviolet (UV) or diode-array detection (DAD) ультрафиолетовым (УФ) или диодно-матричным обнаружением(DAD)

• gas chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS) • газовая хроматография с масс-спектрометрическим обнаружением(GC-MS)

• liquid chromatography with mass spectrometric detection (LC-MS) (Food • жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим обнаружением(LC-MS)

HPLC with UV/DAD is a relatively rapid way of measuring phytoestrogens ВЭЖХ с УФ относительно быстрый способ измерения фитоэстрогенов

compared to MS-based methods (Coward et. al. , 1998; Murphy et. al. , 1999; по сравнению с MS-методы. Преимуществом этого метода является то, что только гидролиз и получение образцов необходимые перед анализом. On the other hand; since isoflavonoid levels in non-soy foods are much lower than in С другой стороны, УФ обнаружения не достаточно чувствительны для анализа образцов сthese expected low levels of isoflavonoids (Mazur et. al. , 1996; Mazur and ожидаемым низким уровнем изофлавоноиды.In general, if food samples containing phytoestrogen In general, the mobile phases employed with RP-HPLC columns have beenПодвмжная фаза:acetonitrile and/or methanol in combination with water containing small amounts of ацетонитрила и / или метанол в сочетании с водой, содержащей небольшое количествоan acid (Wang et. al. , 2002). кислоты using elution with a gradient of methanol or acetonitrile in an acidic (0.1-1 % acetic, (0.1-1%-ной уксусной,formic, or trifluoroacetic acids) or neutral (10 mM ammonium acetate or ammonium муравьиной, или трифторуксусной кислоты) или нейтральный (10 мМ ацетата аммония или аммонияformate) solvent. формиат) растворитель. Для достижения максимальной чувствительности, the UV spectra of all analytes were recorded in the УФ-спектры всех аналитов были записаны вrange of 200-400 nm. диапазоне 200-400 нм. Based on the spectral data На основании спектральных данных (Figure 2) UV detection was chosen at 244 nm for  UV обнаружения был выбран на 244 нм для daidzein and coumestrol, and at 258 nm for даидзеина и куместрол, и при

258 нм дляglycitein and genistein. глицитеин и генистеин[9].

Открытие и исследование структуры фитоэстрогенов.

Фитоэстрогены были открыты в 1926 году. В этот же период проводились исследования, направленные на  изучение их структуры и биологических свойств[2].

Наиболее яркие примеры влияния гормоноподобных соединений растительного происхождения на репродуктивную функцию сначала стали известны из ветеринарной практики. В 1946г. у овец Австралии, выпас которых производился на пастбищах, богатых клевером вида Trifolium subterranium, было описано состояние, названное “клеверная болезнь” и характеризовавшееся нарушением функции яичников и резким снижением плодовитости вплоть до бесплодия. “Клеверную болезнь” связали с преобладанием в пище животных клевера. Оказалось, что изофлавоноиды составляют 5% сухой массы этого вида растения. Позднее симптомы “клеверной болезни” были описаны у крупного рогатого скота, кроликов и некоторых видов оленей. Кроме того, у самок животных, питавшихся богатыми изофлавонами растениями, отмечено появление признаков лактации вне беременности, это явление наблюдалось даже у самцов. Было установлено, что в механизме описанных расстройств основным является нарушение рецепции эндогенных эстрогенов гормоночувствительными клетками гипоталамуса, вследствие интенсивного связывания с ними фитоэстрогенов[1].

В организме животных и людей фитоэстрогены впервые обнаружены в конце 60-х годов. Сначала из мочи обезьян были выделены лигнаны - энтеролактон и энтеродиол, затем из мочи людей – метайрезинол и ларицирезинол, а также фитоэстрогены типа изофлавоноидов: формононетин, метилэквол, диметилангиолензин, дигидрооксиизофлован и др. Большинство из названных соединений были обнаружены также в коровьем молоке. В опытах in vitro было доказано, что фитоэстрогены по структуре обладают определенным сходством с эстрогенами животных и имеют близкую с ними молекулярную массу. Исследуемые фитоэстрогены (лигнаны) активно реагировали с рецепторами к эстрогенам клеток рака молочной железы человека, что позволило рассматривать фитоэстрогены в качестве соединений, обладающих способностью мимикрировать или блокировать действие эндогенных эстрогенов[1].

Род клевера (Trifolium) представлен  250 видами и принадлежит к семейству растений Leguminosae. Интересующий  нас вид красный клевер (Trifolium pratense)  культивируется в Европе с III – IV века. Он  быстро стал важной культурой, благодаря таким качествам, как быстрый рост и почвоулучшающие характеристики. К концу Первой мировой войны в Германии красный клевер заменял овощи. В этот же период времени были проведены его первые токсикологические исследования[2].

В 1950 году  Роре с соав. впервые определил и идентифицировал вещество  в экстракте красного клевера, обладающие эстрогенной активностью– биоканин-А[2].

В 1965 году Schulz показал, что биоканин-А и формононетин присутствуют в красном клевере в виде гликозидов[2].

В 80-ые годы был доказан противораковый эффект биоканина А – одного из изофлавонов, содержащихся в красном клевере[2].

Лекарственные растения содержащие фитоэстрогены.

Linum usitatissmi – лен обыкновенный

Linaceae – сем. льновые

Semina Lini – семена льна