Амілолітичні ферменти

     В даний час для визначення кількості  білка широко користуються вимірюваннями  інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в  білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у  різних білках по-різному і, отже, інтенсивність  неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у  розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність  дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання  і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива  швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і  до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі.

Спектрофотометричні методи

     Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами  ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі  певних груп - аналітичних форм. Для  вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей  метод відрізняється високою  чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і  реактивів і дозволяє стежити  за перебігом реакції у часі. Для  цього реакційну суміш поміщають  в кювету, вставлену в термостатуємий кюветотримач. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або  субстрату) і швидкого перемішування  вимірюють поглинання при довжині  хвилі, характерної для використовуваного  субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо  концентрацію деяких ферментів (після  достатньої очищення) за величиною  характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно вибрану  одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці  залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість  ферменту, що викликає певну зміну  в оптичної щільності за певний час  за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість  ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і  т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного  препарату, виражають числом одиниць  в 1 мг речовини (білка).

Манометричні  методи і інші методи

     Ці  методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в  газоподібному стані. До таких реакцій  відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення  і декарбоксилювання, що супроводжуються  поглинанням або виділенням кисню  і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії  продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах - манометричних апаратах Варбурга.

     Інші  методи: сюди відноситься великий  ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу  на папері. Ці методи високочутливі  і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі  хроматографії (та електрофорезу).

6. Визначення залежності дії ферментів від рН середовища

     Амілолітичну  активність характеризує здатність  ферментів каталізувати гідроліз крохмалю до декстринів, які не забарвлюються  йодом.

     Метод характеризує активність а-амілази, але при наявності в препараті в-амілази і глюкоамілази цим методом визначають сумарну дію всіх амілолітичних ферментів.

     За  одиницю амілолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, що каталізує розщеплення 1 г розчиненого  крохмалю до декстринів, які не забарвлюються  йодом, за 1 год при температурі  30^оС у чітко визначених умовах. Амілолітичну здатність (АЗ) препарату виражають числом указаних одиниць в 1 г сухого препарату чи в 1 мл розчину. При такому способі вираження АЗ безпосередньо показує скільки грамів крохмалю може бути прогідролізовано до нездатних забарвлюватися йодом декстринів 1 г препарату, культури чи 1 мл розчину за 1 год.

     Мета  роботи: засвоїти методику визначення амілолітичної активності ферментного препарату.

     Апаратура: водяна баня, секундомір.

     Лабораторний  посуд: мірні колби, піпетки, пробірки, скляні палички.

     Матеріали і реактиви: 1,0 % розчин розчинного картопляного крохмалю (наважку беруть з такого розрахунку, щоб в 100 мл розчину був 1 г сухого крохмалю, кількісно переводять її у велику склянку з киплячою водою, кип'ятять 2 хв й охолоджують, весь час перемішуючи розчин скляною паличкою. Охолоджений кромаль переносять у мірну колбу того об’єму, із розрахунку на який взята наважка крохмалю, додають буферний розчин у кількості   10 мл на 100 мл розчину і доводять до позначки дистильованою водою. Розчин крохмалю готують у день аналізу); буферний розчин: змішують рівні об’єми нормальних розчинів оцтової кислоти (58 мл льодяної оцтової кислоти в 1 л дистильованої води) та натрій оцтовокислого (82 г CH₃COONa або 136,1 г CH₃COONa*3H₂O в 1 л води), рН=4,7; основний розчин йоду (1,4 г кристалічного і 4,4 г калій йодистого розчиняють у малому об’ємі води і доводять об’єм розчину до 100 мл, зберігають у темному місці); робочий розчин йоду готують в день аналізу (20 мл основного розчину йоду доводять дистильованою водою до 100 мл і на кожні 100 мл робочого розчину додають 4 г йодистого калію); розчин технічного амілосубтиліну (1:1000).

     Принцип методу ґрунтується на гідролізі 1,0 %-го буферного розчину крохмалю під впливом мілолітичних ферментів. Кінець реакції контролюють візуально  за йодною пробою. За часом, протягом якого  проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

     Хід роботи. У конічну колбу місткістю 50-100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30 ⁰С. Загальний об’єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об’єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

     Через 10 хвилин витримування в бані у колбу  вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно зв секундоміром відмічають час. За початок реакції  беруть час, коли з піпетки виллється  половина вмісту. Через кожну хвилину  після початку реакції скляною  паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці  з’єднують її з раніше нанесеною  краплиною робочого розчину йоду.

     Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну  забарвлення при з’єданнні з  краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 секунд).

     Час, за який проходить розеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але  надійніші результати отримують  у межах від 5 до 15 хв.

     Скляну  паличку після кожної проби промивають дистильованою водою і витирають  чистим некрохмаленим рушником.

     Розрахунок  АЗ проводять за формулою:

     ,

     де 0,2 – кількість крохмалю в реакційній суміші; 60 – коефіцієнт перерахунку на 1 годину; а – кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мілілітри рідинних об’єктів; t – час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатни забарвлюватися йодом продктів, хв.; 1 – перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.

     Аналізують  одержані результати, складають висновки і рекомендації.

     Опрацювання результатів роботи

Розрахунки

1. для рН=2:

 

2. для рН=4,7:

 

3. для рН=7: 

 

4. для рН=11:

 
 
 
 

 

  Висновок

      В даній роботі ми визначили амілолітичну здатність ферментного препарату  за швидкістю гідролізу крохмалю до декстринів. І побачили, що активність ферменту залежить від рН. Так, при рН=4,7 та рН=7 фермент проявляв найвищу амілолітичну активність (902,26 і 774,19 відповідно), а при рН=11 – найменшу (22,33). При рН=2 амілолітична здатність ферментного препарату становила 34,5.

 

Список  використаної літератури

1. Біохімія: Лабораторний практикум для студ. технолог. спец. ден. форми навчання/ Уклад.: А.І. Салюк, А.В. Котинський, О.І. Семенова, Н.О. Бублієнко – К.: НУХТ, 2011. – 61 с.
2. Биохимия: Учебник/Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев и др. – К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1988. – 432 с.: ил.
3. Грачева И.М. , Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.
4. Химическая энзимология: Учебник/Сергей Дмитриевич Варфоломеев. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 480 с.
5. http://revolution.allbest.ru/medicine/00188183_0.html