Амілолітичні ферменти

     в-амілази  виявляють більшу стабільність у  відсутність іонів Са^2+. Молекулярна маса в-амілази рослин досить висока, вона складає від 50000 до 200000. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць до 50 000 кожна. Фермент містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Вважається, що (в-амілазу має високу здатність до нескінченої атаки субстрату. Для амілози середньої молекулярні маси в одному при з'єднанні ферменту до субстрату можливо відчеплення до чотирьох залишків мальтози. При збільшенні молекулярної маси субстрату можлива і більша кількість місць атаки.

     Продукт реакції - мальтоза - має в-конфігурацію. Гідроліз іде по лінійному ланцюзі  тільки до б-1,6-зв'язків. При гідролізі  крохмалю утворюється 54-58% мальтози і 42-46% високомолекулярних декстринів (в-декстринів). в-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са. Фермент  може складатися з однієї або чотирьох субодиниць, містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Властивості  в-амілаз залежать від джерел їх виділення. Для отримання мальтози з крохмалю використовують бактеріальні в-амілази.

     Глюкоамілаза (1,4-б-D-глюканглюкогідролаза) широко рас-розлогий в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тканинах тварин. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, г-амілаза, лізосомальних б-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо-б-1 ,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків б-D-глюкози з нередуцірующіх решт субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати б-1 ,6-глюкозідние зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за б-1 ,6-зв'язком слід б-1 ,4-зв'язок, тому декстран ними не гідролізується. Глюкоамілаза значно швидше гідролізують полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди- і моносахаридів.

     Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які  складаються з оліго-, ди-і моносахаридів. Угле ¬ водний компонент може бути цілісним фрагментом або ж розбитими на індивідуальні сполуки, які прикріплюються до білка через треонін і серин. Наприклад, у глюкоамілази A. niger їх 20. Більшість відомих глюкоамілаз має оптимум при рН 4,5-5,2, рідше - при 5,7-6,0, в основному для дріжджових глюкоамілаз.

     Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогідролаза) раніше був відомий під назвами: R-фермент, гранична декстриназа або амілопектин-6-глюканогідролаза. Пуллуланаза, як і б-амілаза, є ендогенних ферментом, але на відміну від неї здатна невпорядковано гідролізувати б-1 ,6-зв'язку в пуллулані, амілопектину, глікогену та граничних декстрину, одержуваних при спільному впливі на крохмаль і глікоген б-і в - амілаз. Якщо між двома б-1 ,6-зв'язками розташовано більше трьох залишків глюкози, то розрив б-1 ,6-зв'язку йде значно повільніше, тому амілопектин гідролізується пуллуланазой гірше за інших розгалужених полісахаридів. Найбільш частим відщеплює фрагментом є мальтотріоза. Пуллуланази з різних джерел мають різні властивості[7].

     Ізоамілаза (глікоген-6-глюканогідролаза), або дебранчінг-фермент, гідроліз б-1 ,6-зв'язку в розгалужених полісахаридів, таких як амілопектин, глікоген, в-граничні декстрини. Відмінною особливістю ізоамілази в порівнянні з пуллуланазой є те, що вона не здатна гідролізувати пуллулан і слабко діє на граничні в-декстрини. Бактеріальна ізоамілаза розщеплює б-1 ,6-зв'язку в глікогенній повністю, а пуллуланаза діє на цей субстрат слабо. Ізоамілазу утворюють багато мікроорганізмів, такі як B. amyloliquefacie, Cytophaga, Streptomyces, Pseudomonas amyloderamosa, Saccharomyces cerevisiae та ін, ферменти яких мають здатність гідролізувати субстрат при рН від 3,5 до 6,5 і температурах від 25 до 53 ° С. Ізоамілаза не стабілізується кальцієм, за винятком ферменту з Cytophaga. Молекулярна маса ізоамілаз коливається від 90 до 120 кДа.

     б-глюкозидази (б-D-глюкозідглюкогідролаза) має здатність гідролізувати б-1 ,4-зв'язку від нередуцірующего кінця субстрату з відщеплення залишку глюкози. Фермент проявляє найбільшу спорідненість до низькомолекулярним субстрату, легко гідролізують мальтозу, олігосахариди, а полісахариди гідролізують повільно або зовсім не гідролізують. б-глюкозидази об'єднує групу ферментів і має ряд інших назв: мальтаза, глюкоінвертаза, глюкозідосахараза. Властивості ферментів, які продукуються різними мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися. Фермент має здатність до перенесення б-D-глюкозільних залишків на відповідні акцептори, часто з утворенням б-1 ,6-зв'язків.

     Декстраназа (1,6-б-D-глюкан-6-глюканогідролаза) каталізує розщеплення б-1 ,6-зв'язків у бактеріальному полісахариди декстрану. Серед продуцентів декcтраназ слід зазначити B. subtilis, B. megaterium, Lactobacillus befidus, Streptococcus mutans, Bravibacterium fuscum, Pseudomonas UQM-733, різні грунтові бактерії, а також численні види мікроскопічних грибів роду Penicilium, Aspergillus і Fusarium. Декстранази мають молекулярну масу від 35 до 71 кДа; вони є слабокислими білками. Ізоелектричної точка для всіх грибних декстраназ лежить в діапазоні від 4,0 до 4,6. Для більшості бактеріальних декстраназ оптимальна температура каталітичної дії 35-37 ° С; для грибних продуцентів температура трохи вище - 55-60 ° С. Оптимальне значення рН коливається в залежності від виду продуцента від 4,4 до 7,5. За допомогою ендодекстраназ можна отримувати з декстрану кровозамінники необхідної молекулярної маси; їх також використовують у стоматології для зняття зубних бляшок, що складаються з декстраноподобних глюканов.

     Амілаза B. Macerans [1,4-б-D-глюкан-4-б-(1,4-б-глюкану) трансфераза (ціклізующая)] Ця унікальна амілаза, яка вперше була знайдена в культурі B. macerans. Вона циклізує частину ланцюга 1,4-б-глюкану шляхом утворення 1,4-б-глюкозідной зв'язку. Робоча назва цього ферменту - циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза). При дії на крохмаль і аналогічні субстрати утворюються циклічні нередукуючі декстрини (декстрини Шардінгера) різних розмірів.

     Фермент діє на лінійні полісахариди, гідролізуючи насамперед б-1 ,4-зв'язок, і потім  переносить звільнився редукуючий кінець ланцюга на НРК. Фермент також  здатний перебудовувати лінійну  структуру мальтодекстрин без циклізації, може переносити залишки глюкози  і мальтози на олігосахариди, тобто  має за певних умов трансферазну активність і здатний ввести реакцію конденсації. 

3. Джерела одержання амілолітичних  ферментів

     До  розвитку ферментної промисловості  головним промисловим джерелом отримання  амілаз в європейських країнах було проросле зерно (солод). Для медичних цілей амілази отримували з тваринної  сировини. В даний час головним джерелом амілаз є прокаріоти, особливо бактерії, гриби і найрідше дріжджі.

Прокаріоти

     Серед бактеріальної мікрофлори найбільш ефективними продуцентами є такі мікроорганізми: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans і Вас. polymycus та ін.

     Бацили - продуценти амілолітичних ферментів  представляють собою в більшості  випадків Г⁺ палички довжиною 1,2 ... 1,3 мкм і діаметром 0,6 ... 0,8 мкм. Палички з'єднуються по два, три, іноді утворюють ланцюжки. собою утворюють спори, що надають стійкість клітині при дії несприятливих умов. Такі форми легко переносять висушування, низькі та високі температури, опромінення і т. д. Цикл розвитку бактерій порівняно короткий.

     рН-стабільність мікробних глюкоамілаз лежить в  широкому діапазоні від 2,5 до 9. Термостабільність  глюкоамілаз лежить в інтервалі  від 30 до 45 ° С і рідко підвищується до 55-60 ° С. Глюкоамілази різного  походження помітно відрізняються  по молекулярній масі, яка, за даними різних авторів, має значення від 48 000 до 210 000.

     Бактерію  Вас. subtilis-82, що застосовується в даний  час на спиртових заводах як продуцент  б-амілази в суміші з препаратами  глюкоамілази, вирощують протягом 48 ... 60 годин при температурі +30 - +35 ° С.

     Особливість застосування бактерій у виробництві - їх здатність утворювати високоактивну  термостійку б-амілазу. Для розрідження крохмалю також застосовуються амілолітичні препарати, що містять б-амілазу: б-амілаза гідролізує внутрішні альфа-1,4-глікозидні зв'язки крохмалю, приводячи до швидкого зниження в'язкості клейстеризованих розчинів крохмалю, тим самим забезпечуючи підготовку сусла до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії бактеріальної альфа-амілази на крохмаль є низькомолекулярні розчинні декстрини з невеликим змістом моно-і дисахаридів (глюкози і мальтози).

Дріжджоподібні  гриби

     Амілолітичні  ферменти синтезують також деякі  дріжджі і дріжджоподібні гриби  родів Saccharomyces, Candida, Endomycopsis і Endomyces.

     Відомо  більше 100 видів дріжджів, які добре  ростуть на крохмалі як на єдиному  джерелі вуглецю. Серед них особливо виділяються два види, які утворюють  як глюкоамілази, так і в-амілази, ростуть на крохмалі з високим  економічним коефіцієнтом і можуть не тільки асимілювати, але і зброджувати  крохмаль: Schwanniomyces occidentalis і Saccharomycopsis fibuliger. Обидва види - перспективні продуценти амілолітичних ферментів на крохмалевмісних відходах.

     У спиртовому виробництві знайшли  застосування дріжджоподібні гриби  End. bispora і End. species 20-9, що вирощуються глибинним способом і продукують головним чином активну глюкоамілазу; активність ферменту виявляється слабо. Високоактивний End. bispora має розгалужений міцелій, утворює бластоспори; гіфи - септовані, зернисті; на твердих агаризованних середовищах пророщують колонії з повітряним сірувато-білим міцелієм, на рідких поживних середовищах - гіфи і деяка кількість бластоспор.

     Дріжджоподібні  гриби в спиртовому виробництві  самостійно не застосовують, тому що вони не містять інших ферментів, необхідних для нормального оцукрювання  сусла з крохмалевмісної сировини. Зазвичай їх використовують у суміші з ферментними препаратами з  мікроскопічних грибів чи бактерій.

Мікроскопічні гриби

     Для отримання амілаз широко застосовують мікроскопічні гриби роду Aspergillus, видів: niger, oryzae, usamii, awamori, batatae, роду Rhizopus, видів: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum та ін, А також окремі штами Neurospora grassa і Mucor.

     Мікроскопічні гриби дуже широко поширені в природі; основне місце їх проживання - грунт.

     Всі роди і види мікроскопічних грибів характеризуються нитковидною будовою  тіла і специфічною будовою плодоносних  органів. Тіло гриба складається з довгих переплетених ниток сіруватого або білого кольору, що називаються гіфами. Вони поширюються по поверхні поживного субстрату, утворюючи міцелій, і частково вростають в нього. Деякі гіфи, що піднімаються над поверхнею у вигляді легкого пуху, мають більш складну будову і мають органи плодоношення, що називаються конідіями або спорангієносцями. У мукорових грибів на спорангієносця знаходиться кулевидне здуття, оточене оболонкою, всередині якого утворюються спори. У аспергіллів кінець конідієносця має булавкоподібні потовщення, від якого відходять подовжені клітини, звані стеригмами; від стеригм відшнуровуются більш дрібні круглі клітини - конідії

     Відокрелені конідії або спори, потрапляючи  у сприятливі умови, починає проростати, потім гіфи гілкуються, утворюючи  міцелій; при виснаженні живильних  речовин у середовищі гриб переходить у стадію споро- або конідієутворення. Спори і конідії мікроскопічних грибів містять пігменти, що і додає зрілим культурам характерного забарвлення. Спори розвиваються трьома різними способами, в залежності від виду мікроскопічного гриба:

· як круглі ділянки в межах мережі гіфів;

· як речовина в торбинці на кінці антени Гіфа;

· як схожі  на ланцюгу ділянки на кінці антени Гіфа

     Аспергілли - типові аерофіли, тому вони можуть розвивватись тільки на поверхні твердого або рідкого  середовища або в рідкому середовищі, що аерується. Оптимальна температура  для більшості аспергіллів +25 - +30 ° С, для деяких - до 35 ° С. Більшість  грибів при поверхневому культивуванні  можуть переносити короткочасне підвищення температури до 40 ° С і навіть 45 ° С без помітної втрати активності ферментів. Оптимальна вологість середовища для них близько 65%.

     Для живлення аспергіллів необхідні  вуглеводи, азотисті і мінеральні речовини. Як джерело вуглеводу, крім моносахаридів, багатьох оліго- і полісахаридів, можуть бути спирти і органічні кислоти, однак для накопичення амілази  в середовищі обов'язково повинні  бути присутніми крохмаль, декстрини  або мальтоза. У середовищах, що містять  інші цукри, в тому числі глюкозу, гриби не утворюють амілази. Джерелом азоту можуть бути білки і їх гідролізати, амонійні солі та нітрати.

     Середа  повинні містити сполуки, до складу яких входять сірка, фосфор, калій, магній і мікроелементи. Більшість мікроскопічних грибів засвоюють сірку з сульфатів, а фосфор - з фосфатів. Аспергілли не потребують готових вітамінах  та фактори росту, тому що здатні самі синтезувати їх з більш простих  сполук, що є в середовищі. Препарати  ферментів з мікроскопічних грибів включають, як правило, широкий набір  ферментів, тому можуть повністю замінювати зерновий солод.

4. Механізм дії амілолітичних ферментів

     Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, і глікоген.

     Крохмаль  – рослинній полісахарид з  дуже складною будовою. Містить 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю.