Амілолітичні ферменти

     При вивченні механізму дії амілолітичних  ферментів є певні складності, і перш за все вони полягають у  тому, що субстрат - крохмаль - неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімеризації глікозидного ланцюга і кількості розгалужень.

     Реакції, що каталізується амілазами, мають  дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу стаціонарну. Під час  першої стадії ендоамілаза швидко зменшує  молекулярну масу субстрату, утворюючи  суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи. Тому кінцеві продукти гідролізу а-амілазами можуть бути різними. Перша стадія впливу ферменту на субстрат хоча і носить неупорядкований характер, має для всіх видів амілаз схожий механізм.

     Існує дві гіпотези про механізм дії  екзоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза припускає, що, впливаючи на субстрат по одноланцюжкові або «молніеобразному»  механізму, екзоамілаза утворює  фермент-субстратний комплекс із захопленням  нередукуючого кінця ланцюга.

     Подальше  просування ферменту з цього ланцюга  відбувається до повного її гідролізу. За другою гіпотезою (б- і глюкоамілаза діють на субстрат шляхом механізму  множинної атаки, тобто фермент  утворює комплекс з молекулою  субстрату, потім через кілька етапів цей комплекс розпадається і фермент  зв'язується з новою молекулою  субстрату. Іншими словами, при множинної  атаці відбувається щось середнє  між неврегульованим механізмом і одноланцюжкові, «молніеобразной» атакою. Для повного гідролізу  з цього механізму одна молекула субстрату повинна утворювати багато разів фермент-субстратні комплекси. При цьому можливий гідроліз декількох  зв'язків в одному каталітичному  акті.

   Механізм  впливу амілаз на субстрат може бути розглянуто з не-скількох позицій:

1) вид  що розривається зв'язку (б -1,4 або б-1,6);

   2) тип впливу на субстрат (ендо- або екзо-);

   3) вплив на швидкість гідролізу  ступеня полімеризації субстрату;

   4) можливість гідролізу олігоcахаридів;

   5) здатність ферменту до множинної  атаці субстрату.

   Наявність ознак амілаз, відображених в 3 і 4 позиції, при дії на лінійні субстрати  може свідчити про існування у  цих ферментів подцентровой структури. Ймовірно, активний центр амілази  може складатися з декількох підцентру, кожен з яких може вступати в контакти з глюкозних залишком. Енергія взаємодії (А;), виражена в одиницях вільної енергії (кДж / моль), визначає подцентровое спорідненість ферменту до субстрату. Це спорідненість індивідуально і може бути як позитивним, так і негативним. Ймовірність існування підцентрових структур амілаз допомагає встановити будову активного центру амілаз, дає чітке пояснення субстратної специфічності, але не дає пояснень механізму гідролізу розгалужений субстратів.

3. Промислове одержання амілолітичних ферментів

     Існує два способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів: поверхневий  і глибинний.

     Перший  спосіб, який застосовується для культивування  мікроскопічних грибів, характеризується розвитком міцелію на поверхні твердого або рідкого субстрату. На рідкому  субстраті утворюється плівка міцелію, яка продукує не тільки амілолітичні ферменти, але й органічні кислоти, що їх інактивують, тому використовують тверді субстрати з розвиненою поверхнею - пшеничні висівки, дробину барди, картопляну мезгу та ін. Максимальна активність ферментів досягається при культивуванні  грибів на пшеничних висівках. Дробина  барди бідна живильними речовинами, і активність ферментів у культурах  грибів, вирощених на ній, в 4-5 разів  нижче, ніж на висівках. Зріла культура грибів внаслідок обволікання часток висівок міцелієм має вигляд щільної  войлокоподібної маси. При поверхневому культивуванні пшеничні висівки  повинні бути зволожені і простерилізовано. У стерильних умовах готують посівну  культуру, але вирощують гриби  в нестерильних умовах у кюветах, які встановлюються в негерметичних  ростильних камерах. Теплоту, що виділяється  в процесі росту грибів, видаляють  продування через ростильну камеру стерильного кондиціонованого повітря.

     Поверхневий спосіб вирощування мікроскопічних грибів має ряд переваг. Так як під час росту гриба висівки  не перемішуються, сторонні мікроорганізми не розповсюджується по всій їхній  масі і викликають лише незначне місцеве  інфікування, яке, як правило, не впливає  на активність ферментів. Це, однак, не виключає необхідності ретельної стерилізації повітря, середовища і обладнання. Культуру на висівках висушують до вмісту вологи 10 ... 11%. У такому вигляді вона може зберігатися тривалий час без  значної втрати активності. Це дозволяє організувати централізоване постачання спиртових заводів сухий культурою  мікроскопічних грибів, що є одним  з переваг поверхневого способу  вирощування.

     Недолік поверхневого способу - необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими  важко механізувати. Собівартість культури гриба-продуцента висока, причому в основному через витрати великої кількості ручної праці. Механізація процесу вирощування можлива шляхом забудівлі безперервнодіючих установок або бескюветних апаратів з вертикальним товстим шаром живильного середовища та інтенсивним продування повітря через цей шар.

     Глибинну  культуру мікроорганізмів вирощують  на рідкому поживному середовищі при енергійної аерації в герметично закритих апаратах та в стерильних умовах. Процес повністю механізований. Стерильність глибинної культури мікроорганізма - продуцента ферментів позитивно  відбивається на результатах зброджування сусла дріжджами.

     Культура, що виросла в нерухомому шарі при  поверхневому культивуванні, представляє  собою корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних міцелієм, що зрісся. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при  температурах не вище 40^оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних  культур мікроорганізмів

     Для отримання амілолітичних ферментних препаратів у нашій країні переважно  використовується глибинний спосіб культивування. У цьому випадку  мікроорганізми вирощуються в рідкому  поживному середовищі. Технічно більш  досконалий, ніж поверхневий, так  як легко піддається автоматизації  та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні, зазвичай, значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

     Підготовка  живильного середовища: головним джерелом вуглецю для всіх продуцентів  б-амілази є крохмаль різного  походження, який вводиться в середу в клейстерізованому стані. Може використовуватися і крохмалевмісну сировину. Біосинтез б-амілази протікає більш інтенсивно, якщо крохмаль частково гідролізувати, не допускаючи накопичення  в середовищі низькомолекулярних вуглеводів наприклад гідролізат крохмалю. Склад  живильного середовища може включати й інші різні вуглеводвмісні речовини: гідролізат крохмалю, кукурудзяної муки, кормових дріжджів, лужний екстракт кукурудзяної муки. Неорганічні речовини: (NH₄) ₂HPO₄, CaCl₂, MgSO₄, KCl. Деякі компоненти попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерування. До - тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після - тоу що несе клітини продуцента [2, 6, 29].

     Одержання посівного матеріалу: для засіву живильного середовища матеріал готують  також глибинним методом. Вид  його залежить від продуцента: для  грибів це міцеліальна вегетативна  маса, для бактерій - молода зростаюча  культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу  полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу  залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується  лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне  спороношення - скорочується до 1%.

     Посівний  матеріал як на окремих стадіях, так  і готовий піддають ретельному мікробіологічний контроль. Він не повинен бути інфікований  сторонньою мікрофлорою, в ньому  має міститися певна кількість  спор або клітин на одиницю маси, генетично закладені в ньому  властивості продукувати ферменти повинні стійко зберігатися.

     Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервної подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжа середу або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.

     Відомі  наступні різновидності глибинного культивування: періодичний, безперервно-циклічний  і безперервно-проточний.

     1. Періодичний спосіб характеризується  незмінність живильного середовища  в ферментера, склад якої в  процесі розвитку поступово змінюється. Процес протікає постадійно: у  ферментер набирають живильне  середовище і задають посівний  матеріал; після розмноження мікроорганізмів  і накопичення продуктів їх  обміну зрілу культуру вивантажують, а все обладнання, комунікації  та запірні пристрої пормивають, а потім стерилізують парою.

     2. При безперервноциклічному способі  мікроорганізми, розташовані на  нерухомої насадці у ферментері, омиваються середовищем, що протікає  в замкнутому контурі, до повного  споживання ними поживних речовин.  Після цього зрілу культуру  вивантажують, починаючи з останнього, апарати промивають, стерилізують  і цикл повторюють з останнього  голів ¬ ного ферментера. Багата  поживними речовинами середу  під час такої циклічної ферментації  поступово виснажується; за часом  перебування середовища в зоні  реакції цей процес більш тривалий, ніж періодичний.

     3. Безперервно-проточний спосіб культивування  мікроорганізмів більш досконалий. Суть його полягає в тому, що  мікробна популяція розвивається  в проточному поживному середовищі. Спосіб має два різновиди: гомогенно-неперерваним  і градієнтні-безперервний. У першому  випадку вирощування ведуть в  одному ферментері; при ретельному  перемішування середовища та  аерації забезпечується однакове  стан культури в усьому об'ємі  рідини. У ферментер при цьому  не безперервно надходить свіжа  середи, а з нього також безупинно  випливає надлишок зрілої культуральної  рідини.

     4. Градієнтні-безперервне культивування  здійснюють в батареї ферментера, з'єднаних переточні трубами.  Середовище, що засівають, з великим вмістом вуглеводів і інших інгридіентів безупинно перетікає з одного ферментера в інший і також безперервно витікає у вигляді готової культури.

     Безперервним  культивуванням у проточних середовищах  можна вирощувати мікроорганізми в  умовах, оптимальних для їх стадії розвитку. При цьому такі важливі  фактори, як концентрація поживних речовин, кількість продуктів обміну, рН, вміст розчиненого кисню, різко  змінюються при періодичному способі  культивування, підтримуються по стояли на заданому рівні або змінюються по розробленній програмі.

     Виділити: У міцелії тридобовий культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. У цьому  випадку препарати ферментів  виділяють з фільтратів після  відділення біомаси.

     Концентрування: для отримання ферментних препаратів з індексом Г3х фільтрат або культуру концентрують, після чого суміш направляється  на сушіння. Глибинні культури мікроскопічних грибів в рідкому вигляді не можуть зберігатися тривалий термін без  втрати активності, перевозити їх на великі відстані внаслідок значного вмісту в них води (до 85 ... 90%) також економічно не завжди виправдано. Тому при організації  постачання культурою спиртових  заводів доцільно її попередньо концентрувати.

     Концентрування  культур можна здійснювати на вакуум-випарних установках з отриманням сиропів при температурах, що забезпечують збереження ферментів, або на розпилювальних сушарках з отриманням порошкоподібного ферментного препарату. Однак ці способи супроводжуються значними втратами активності (до 50%) і тому не знайшли поширення на спиртових  заводах. Починаючи з сімдесятих років у ВНІІПрБТ був розроблений  і впроваджений на Мічурінському  експериментальному заводі спосіб концентрування глибинних культур ультрафільтрації.