Амілолітичні ферменти

     Спосіб  заснований на проведенні процесу фільтрації через ряд напівпроникних мембран, в результаті чого ферменти та інші високомолекулярні речовини затримуються або виводяться з апарату у  вигляді ультраконцентрату (концентрованого  сиропу). Вода і частина низькомолекулярних речовин (пермеат) проходять через  мембрани і також видаляються.

     Втрати  активності при ультрафільтрації складають  до 15% в перерахунку на первинну активність вихідної висвітленої культуральної  рідини.

При використанні концентрованих препаратів на стадії оцукрювання застосовують звичайне обладнання для фармакотерапевтичної групи ферментних оцукрюючих матеріалів.

     Очищення: для отримання очищених ферментних препаратів використовують традиційні методи, що дозволяє більш ніж у 30 разів підвищити активність препарату. Для відділення амілаз від супутніх ферментів використовується адсорбція  домішок на глинистих матеріалах, зокрема на бентоніт. Одним із прийомів очищення термостабільним амілаз від  протеаз є термоінактівація останніх. Також використовуються методи біоспеціфіческой хроматографії на природних і  синтетичних сорбентах.

     Сушка: висушування препарату повинне  здійснюватися за температури на вході в розпилюючи сушарку не вище 100-120 ° С, на виході - не більше 50-60 °С. При сушці і концентрування велике значення має правильний вибір  стабілізатора ферменту. Введення стабілізаторів у присутності наповнювачів (перліту  та каоліну) в процесі розпилювального  сушіння дозволяє практично повністю запобігти теплову інактивацію  ферментів.

Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих  культур мікроорганізмів

     При поверхневому методі культура росте  на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю обволікає  і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують  поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середу повинна бути пухкої, а шар культури-продуцента невеликим.

     Підготовка  живильного середовища: середовищем  для вирощування продуцентів  є пшеничні висівки з додаванням до 25% солодових паростків, зволожених водою, подкисленной 0,1 н. розчином сірчаної або соляної кислоти. Вихід готової  культури складає звичайно 70-80 мас. % Від маси середовища. Пшеничні висівки - джерело необхідних поживних і  ростових речовин. Крім того, вони створюють  необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів  до висівками можна додавати буряковий  жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром  при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери.

     Одержання посівного матеріалу: продуцентами б-амілази і глюкоамілази найчастіше є бактерії B.subtilis і B.amilosolvents. Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування. Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрювання крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

     Посівний  матеріал може бути трьох видів:

- культура, що виросла на твердому живильному середовищі;

- споровий матеріал;

- міцеліальних культура, вирощена глибинним способом.

     В три етапи отримують і посівну  культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г  зволожених стерильних пшеничних висівок  в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спорообразованія. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у судинах з 500 г середовища.

     Виробниче культивування: режими вирощування  залежать від фізіології продуцента. Культивують протягом 36-48 годин. Зростання  ділиться на три періоди, приблизно  рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28 є С), потім  зростання міцелію у вигляді  гармата сірувато-білого кольору (необхідно  виводити виділяється тепло) та освіта конідій. Для створення сприятливих  умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).

     Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє  корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.

     Виділення та очищення: процес очищення починається  з водної екстракції при 20-25 ° С  з відбором 20-22% розчину; середня  концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для  отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними  розчинниками або солями. Амілази  випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в  розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При  цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин  і целюлози. Стадію виділення і  очищення завершує сушка.

     Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості  при температурах не вище 40 є С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості  використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

     Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам  ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін.

4. Використання амілолітичних ферментів

     На сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати мають широкий спектр застосування в різних галузях промисловості. Великий відсоток застосування ферментів припадає на харчову промисловість, наприклад на виробництво спирту як каталізатора процесу розрідження і оцукрювання сировини. Також ферменти застосовуються в технічний цілях, хімічної промисловості, фармацевтичних цілях, а також у якості діагностичних препаратів.

Хлібопекарська  і крохмалепаточна промисловість

     Дія всіх ферментних препаратів тим помітніше, чим довший процес дозрівання тіста. У зв'язку з чим необхідно встановлювати кількість ферментного препарату в залежності від способу виготовлення тіста і тривалості бродіння напівфабрикатів.

     Так, ферментні препарати, що містять  мальтогенну в-амілазу, призначені для подовження терміну зберігання свіжості хліба за рахунок істотного  зниження швидкості рекристалізації  амілопектинової фракції крохмалю. При температурі клейстерізаціі крохмалю цей фермент розщеплює амілози і амілопектин з освітою в основному олігосахаридів, які сповільнюють процеси черствіння хліба. Внесення цього препарату в тісто робить позитивний вплив на обсяг хліба, суттєво покращує структурно-механічні властивості м'якушки, збільшує термін зберігання свіжості готових виробів до 5-7 діб.

     в-амілаза, оцукрюючи крохмаль, що міститься в тісті, сприяє накопиченню цукрів, необхідних для спиртового бродіння в тісті. Ферментні препарати з амілазою будучи додані в кількості 20-25 г на 1 т борошна, покращують якість і аромат хліба, прискорюють дозрівання тесту на 30%, скорочують витрати на виробництво цукру вищих сортів булочних виробів вдвічі, збільшують пористість м'якушки та об'єм хліба на 20%.

     Амілолітичні  ферментні препарати використовують також у крохмалепаточному виробництві  для отримання різних видів паточно- і глюкозо-фруктозних сиропі.

Пивоваріння та спиртова промисловість

     Амілолітичні  препарати широко випускаються в  нашій країні і за кордоном. В  основному це великотоннажне виробництво. Амілази зна ¬ дят застосування майже у всіх областях, де переробляється крахмалсо-тримає сировину. Амілази  використовують для оцукрювання  зернового і картопляного крохмалю. Найбільшим споживачем амілолітичні ферментів  є спиртова і пивоварна промисловості, де на сьогоднішній день солод (пророщене  зерно) успішно замінюється амілолітітичними ферментними препаратами. Амілази - ферменти прискорюють реакцію оцукрювання  крохмаль. Економічний ефект застосування амілаз досить значний. У пивоварінні  використання ферментних препаратів дозволяє економити 165 г ячменю при виробництві  кожного декалітра пива. Застосування амілази в спиртовій промисловість  можливість повністю відмовитись від  зернового солоду і одночасно  збільшити вихід спирту із сировини на 1,5% при зниженні собівартості декалітра  спирту. Широкі перспективи обіцяє використання ферментів у виноробстві.

Текстильна  промисловість та побутова хімія

     Також ферменти використовують в текстильній  промисловості для розшліхтування тканин і приготування висококонцентрованих клейстером крохмалю в процесі фарбування тканин.

     Амілолітичні  ферменти застосовують у виробництві  пральних порошків. Амілаза виводить з білизни крахмалсодержащіе  залишки їжі. Виробництво ферментів  при виробництві пральних порошків просто необхідно, щоб підвищити  миючу здатність. За оцінками фахівців - технологів частка ферментів в  загальній миючої здатності порошку  становить 30-35%. Навіть незначне додавання  ферментів в пральний порошок  значно збільшує його миючу здатність.

Фармацевтична промисловість

     Амілолітичні  ферменти широко використовують для  лікування захворювань шлунково-кишкового  тракту. Використання цих ферментів  у медицині вельми перспективно, і, безсумнівно буде розширюватися. Труднощі в застосуванні ферментних препаратів для цілей медицини полягають  у необхідності очищення їх від пірогенних речовин, токсинів та інших домішок. Основна функція амілази полягає в переварюванні крохмалю і глікогену. У зв'язку з наявністю полісахаридних фрагментів у складі клітинної стінки бактерій, наголошується розщеплення цих полісахаридів і розвиток бактеріостатичної дії амілази, яка найбільш виражена з ферментів цього підкласу - у лізоциму. Спільна дія цих ферментів забезпечує неспецифічну захист проти бактеріальної інфекції.

5. Методика визначення ферментативної активності амілолітичних ферментів

     Як  правило, ферменти присутні в біологічних  об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє  не кількісний вміст ферментів, а  їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або  накопичення продуктів).

     Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити  за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні  методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості  ферментативної реакції необхідно  вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку  рН розчину, близької до оптимальної  для даного ферменту. Реакцію проводять  при температурі, що лежить в більшості  випадків в межах 25-40 є С. При дослідженні  ферментів, що вимагають присутності  кофакторів (іонів металів, коферментів  та ін), концентрація яких може знижуватися  в міру очищення ферменту, в реакційну  суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і  т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори  до складу досвідчених сумішей. 

Спектрофлюрометричні  методи

     Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання  поглинання світла, але також вимірювання  флуоресценції - спектрофлюрометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценцію і не флуорисцують в окисленому стані.

     Колориметричні (фотометричні) методи

     В основі цих методів лежить вимірювання  за допомогою візуального або  фотоелектричного колориметр пофарбованого  продукту, що утворюється при взаємодії  субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблені кількісні методи, засновані на біуретової реакції, при якій склад білку, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовим мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толіна і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.