Оздоровление посадочного материала в культуре апикальных меристем

     Результати  численних дослідів, в яких з метою  звільнення рослин від вірусу використовувалися  антивірусні препарати, принесли деякі розчарування. Є декілька повідомлень про "виздоровлення" рослин за допомогою таких препаратів; проте часто при цьому висновки авторів грунтуються на експериментах з дуже невеликим числом рослин або ж самі результати експериментів можуть бути інтерпретовані інакше. Жоден із способів хімічної обробки рослин сам по собі ще не знайшов застосування в практиці. Пайн встановив, що ін'єкції диметилсульфоксиду персиковим деревам можуть протягом одного сезону затримувати появу симптомів вірусу мозаїки персика і вірусу некротичної кільцевої плямистості, проте в наступному році ці симптоми з'являються знову. Як вже відзначалося вище, в деяких випадках можна використовувати хімічну обробку у поєднанні з тепловою або з таким методом, як культивування апікальної меристеми.

     Кассаніс  і Тінслі змогли досягти звільнення культури калюсної тканини тютюну від Y-віруса картоплі шляхом додавання до поживного середовища 2-тіоурацила (у концентрації 2 мкг/мл). Досягти регенерації рослин картоплі з безвірусной калюсної тканини не вдалося. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

РОЗДІЛ 2. ОЗДОРОВЛЕННЯ ПОСАДКОВОГО МАТЕРІАЛУ МЕТОДОМ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ 

2.1 Будова та функції меристем рослин 

 Меристеми, або утворюючі тканини, мають здатність до активного росту за рахунок ділення і утворення нових клітин. Меристеми формують усі інші тканини і визначають тривалий (протягом усього життя) ріст рослини. Архітектура розміщення тканин усієї рослини встановлюється на ранніх етапах меристематической діяльності. У тварин меристеми відсутні, чим пояснюється обмежений період їх росту. Ініціальні клітини меристем затримуються на ембріональній стадії розвитку протягом усього життя рослини, а їх похідні поступово диференціюються і перетворюються на клітини різних постійних тканин. Тіло наземних рослин – похідне відносно небагатьох ініціальних клітин.

      Існує два основні типи меристем – апікальні, або верхівкові, і латеральні, або  бічні. (рис. 4).

 Апікальні меристеми розташовуються на верхівках побігів і коріння, забезпечуючи наростання їх в довжину (рис. 5). Такий ріст дістав назву первинного, а самі меристеми – первинних. При цьому частина рослини, утворена первинними

тканинами, що виникли з первинних

меристем, – це його первинне тіло.

 До первинних меристемам окрім  апікальних відносять і їх безпосередні похідні, дещо віддалені від верхівок органів. У цих похідних здатність до ділення певною мірою збережена. Йдеться передусім про протодерм, прокамбій і основній меристемі. У первинному тілі рослини вони дають ще в ході

 ембріогенезу  три первинні системи 

тканин  покривну тканину 

(з протодерму), провідну тканину (з прокамбію) і систему основних тканин (з основної меристеми).

      Латеральні  меристеми розташовуються паралельно бічним поверхням осьових органів, нерідко утворюючи циліндри, на поперечних зрізах, що мають вигляд кілець. Найголовніші латеральні меристемы – камбій і фелоген . Ці меристеми забезпечують наростання стволів в товщину, утворюючи вторинні тканини і формуючи вторинне тіло рослини.

      Інтеркалярні, або вставні, меристеми найчастіше первинні і зберігаються у вигляді окремих ділянок в зонах активного росту.

      Існують також меристеми пошкоджень. Вони утворюються в місцях ушкодження тканин і органів і дають початок  калюсу – особливій тканині, що складається  з однорідних паренхімних клітин, що прикривають місце ураження. Калюсоутворююча  здатність рослин використовується в практиці садівництва при розмноженні  їх брунькуванням і привіванням.

      Клітини апікальних меристем більш-менш ізодіаметричні по розмірах і багатогранні за формою. Міжклітинників між ними немає, оболонка тонка, містить мало целюлози. Порожнина клітини заповнена густою цитоплазмою з відносно великим ядром, що займає центральне положення. Вакуолі численні, дрібні, але під світловим мікроскопом зазвичай не помітні. Пластид і мітохондрій мало, і вони дрібні.

      Клітини бічних меристем різні за величиною  і формою. Вони приблизно відповідають клітинам тих постійних тканин, які  з них надалі виникають.  

2.2 Отримання безвірусного  посадкового матеріалу  методом апікальних

меристем 

     Результати  досліджень показують можливість боротьби з вірусами томатів і огірків  у закритому ґрунті за допомогою  вакцинації рослин непатогенними вірусними  штамами, мутантами вихідних патогенів. Наприклад, вакцинні штами S7 і V-69, отримані у колишньому Всесоюзному інституті захисту рослин (ВІЗР) та Інституті загальної генетики РАН, захищають врожаї багатьох сортів томатів, що уражуються вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ). Збільшення врожаю для таких сортів становить близько 23 %. Одержання стійких проти вірусів сортів гібридизацією із стійкими дикими видами рослин – шлях довгий, особливо якщо потрібно перенести гени стійкості до кількох найбільш хвороботворних вірусів. За допомогою генної інженерії це завдання полегшується. Наприклад, останнім методом створені рослини тютюну і томатів, стійкі проти ВТМ і вірусу мозаїки люцерни.

     Основна перевага клонального мікророзмноження – це отримання генетично однорідного, безвірусного посадкового матеріалу. Це можливо досягти, використовуючи меристемні тканини апексів і бруньок пазушних органів стеблового походження. Як правило, меристема складається з конусного наросту, а також одного або двох листових зачатків (примордій) і є вільною від інфекції.

     Припущення  про можливість відсутності вірусів в меристематичних тканинах рослин вперше висловлено Чунгом в 1938 і Уайтом в 1943 рр. Починаючи з 50-х рр. були зроблені перші успішні досліди з отримання вільних від вірусів рослин жоржини із точки росту. Автори цього методу Морель і Мартін вважали, що в хворій рослині вірус поширюється з відставанням від швидкорослих молодих органів, особливо в молодих недиференційованих тканинах, де концентрація вірусу може знижуватися, аж до повної відсутності. Теоретичні концепції, покладені в основу цього методу, стали з’ясовуватися тільки останнім часом.

     Причини, за якими меристемна зона часто виявляється нездатною підтримувати розмноження вірусу, поки що абсолютно невідомі. Із цього приводу висловлювалися наступні припущення:

• точка росту віддаляється занадто швидко, і вірус просто не встигає її досягти. Це є досить маловірогідним. Солберг і Болд встановили, що верхівка стебла N. glauca переміщується із швидкістю 400 мкм/год (1 см в день). Це дійсно перевищує встановлену швидкість переміщення вірусу від клітини до клітини, але якщо вірус вже потрапив в ту область, де відбувається збільшення розмірів клітин, то із зростанням клітин, очевидно, і він повинен переноситися вперед;
• на шляху вірусу є механічні перешкоди. Наприклад, розміри плазмодезм можуть бути занадто малі. Експериментальні дані, які підтверджували б це припущення, відсутні;
• біохімічний стан клітин, що діляться, унеможливлює реплікацію вірусу. Це всього лише інший спосіб виразити ту просту думку, що ми нічого не знаємо про стан цих клітин.

     Будова точки росту рослин має свою специфіку: дистальна її частина, представлена апікальною меристемою, в різних рослин має середній діаметр до 200 мкм, висота від 20 до 150 мкм.

     У більш нижніх шарах клітин диференційованих меристем, утворюють прокамбій, що дає початок брунькам провідної системи. Відомо, що успіх клонального мікророзмноження залежить від розміру меристематичного експланту: чим більше листових зачатків і тканин стебла, тим легше йде процес морфогенезу, що закінчується отриманням цілої нормальної пробірної рослини. В той же час зона, вільна від вірусних частин, дуже різна. Це залежить також від виду і сорту рослини.

     Особливість будови апікальної меристеми виключає проникнення в неї вірусу шляхом швидкого транспортування провідною системою, не допускає

можливість повільного поширення через плазмодесми, сполучаючи меристематичні клітини. Культивування апікальної меристеми картоплі розміром 200 мкм на поживному середовищі та подальше отриання з неї рослин-регенерантів показало, що серед отриманих рослин лише 10 % були вільні від Х-вірусу, але 70 % – від Y-вірусу картоплі. Обираючи розмір меристемного експланту, необхідно враховувати можливості прийнятого методу одержання максимальної кількості рослин за максимального відсотка безвірусних. Тому перевага віддається використанню експланту гранично малого розміру (0,075 – 0,1 мм) і розробляються оптимальні умови для одержання нормальної пробіркової рослини.

     Застосування  електронної мікроскопії часто виявляє наявність вірусів в меристемі заражених ними рослин, що втім підтверджує загальновідомий факт, що кількість позбавлених вірусу рослин після подібної операції надзвичайно мала і багато меристем уражених рослин інфекційні.

     Таким чином, ефективність застосування апікальної меристеми, як методу оздоровлення заражених вірусами рослин виявляється низькою. Це було доведено результатами, отриманих рядом меристемних лабораторій РФ і Криму, які показують, що з апікальних меристем рослин гвоздик, цимбідіума, уражених вірусами CARMV і CARVMV, в умовах in vitro отримують інфіковані мериклони.

     В принципі можливе отримання безвірусної апікальної меристеми від хворої рослини, але при цьому ризик потрапляння вірусів в здорові тканини має бути знижений до нуля. Це може бути досягнуто шляхом застосування попередньої термотерапії початкових рослин або хемотерапії. 
 

     2.3 Комплексне застосування  методів оздоровлення  посадкового матеріалу (на прикладі Lavandula angustifolia)   

     Застосування термотерапії у поєднанні з меристемною культурою дозволяє оздоровити більше 70 % рочлин-регенерантів хмілю від вірусного хлорозу, 90 % суниць, 25 % рослин чорної та червоної смородини, 50 % малини та більше 80 % картоплі. На наявність вірусів, рослини, як правило, перевіряють за допомогою імуноферментного аналізу, електронної мікроскопії та трав'янистих рослин-індикаторів.

     Для підвищення ефективності виходу оздоровлених меристемних рослин використовують хіміотерапію. Останнім часом отримано позитивні результати у разі внесення в поживне середовище, на якому культивують меристеми, аналога гуанозину – Ір-Д-рибофуранозил-1,2,4-триа-золкарбоксаміду. Цей препарат, що одержав комерційну назву «вірозол» (синтетичний рибавірин), доданий до поживного середовища в концентрації 40 – 200 мл, збільшує відсоток безвірусних меристемних рослин до 80 – 100 % при 0 – 41 % у контролі.

      Для дослідів дослідники відбирали рослини лаванди Lavandula angustifolia  без зовнішніх симптомів інфекційних хвороб. З метою виявлення латентної вірусної інфекції донорні рослини тестували методами біотесту на рослинах-індикаторах та імуноферментного аналізу (ІФА, ELISA) в непрямій (indirect ELISA) та сандвіч (DAS-ELISA) модифікаціях на 96-лункових полістиролових планшетах («Labsystems», Фінляндія). Результати реєстрували на автоматичному ELISA- рідері «Dynex Technologies» при довжині хвилі 405 нм. За позитивний результат приймали показник екстинції, що перевищував показник негативного контролю в 2 рази. Для статистичної достовірності кожен зразок аналізували в 3-кратній повторності. У дослідах з оздоровлення рослин лаванди як експланти культивували апікальні меристеми розміром 0,2, 0,7 і 1,0 мм. Культивували ізольовані меристеми на живильному середовищі МС, доповненому кінетином.

Термотерапії  в умовах in vitro піддавали мікро-пагони (неукоріненні мікророслини) та мікророслини другого пасажу. Режим термотерапії: температура 37±1 °С, освітленість 2-3 клк/м², фотоперіод 16 годин, відносна вологість повітря 60-70 %. У дослідах з хемотерапії використовували віразол (рібавірін, 1-β-D-рибофуранозіл-1,2,4-триазол-3-карбоксамід, «Sigma», Німеччина). Препарат додавали до живильного середовища МС, доповненого кінетином (1,0 мг/л) і гібереловою кислотою (1,0 мг/л), в концентраціях 5,0, 10,0, 20,0 і 30,0 мг/л. На середовищах з віразолом культивували меристеми розміром 0,7 мм. Усі експерименти ставили у двократній повторності, об’єм вибірки становив 20 рослин.

      Встановлено, що при оздоровленні рослин лаванди методом культури апікальних меристем як експланти доцільно використовувати меристеми розміром 0,2 мм, які володіють високою регенераційною здатністю – 87,5-100,0 %. Вихід здорових рослин становить у сорту Синєва – 80,0 %, у сорту Степова – 100,0 %. Підбір умов для проведення термотерапії in vitro лаванди дозволив визначити, що найбільш оптимальною є температура – 37±1 С, експозиція обробки – 10 діб, фотоперіод – 16 годин. Кращим рослинним матеріалом є укорінені мікророслини другого пасажу, які при вказаному режимі зберігають життєздатність на рівні 100,0 %, приріст пагонів становить 25,25-18,02 мм. З відрослих пагонів ізолювали верхівкові бруньки висотою 3-5 мм і культивували на середовищі МС. Приживлюваність бруньок досягала 100,0 % і відбувалося множинне пагоноутворення. Ефективність оздоровлення складала 70,0 % у сорті Синєва і 100,0 % у сорті Степова. Показано, що найбільш прийнятним способом хемотерапії є культивування меристем на середовищіМС, доповненому віразолом у концентрації 20,0 мг/л, протягом 30 днів, який забезпечує одержання 80,0 % безвірусних рослин.