Оздоровление посадочного материала в культуре апикальных меристем

РОЗДІЛ 1. ОЗДОРОВЛЕННЯ ПОСАДКОВОГО МАТЕРІАЛУ ЯК ОСНОВНА ПЕРЕДУМОВА МІКРОКЛОНАЛЬНОГО РОЗМНОЖЕННЯ 

1. Загальна  характеристика мікроклонального розмноження

 

          Вивчення процесу  експериментального морфогенезу  in vitro на всіх рівнях організації – від окремої клітини до верхівки побігу – призвело до створення технології клонального мікророзмноження рослин, яка в більшості країн стала вже комерційною. Термін "клон" (від греч. clon – «нащадок») був запропонований Веббером (1903) для вегетативно розмноження рослин.

     В природі існує два способи розмноження рослин статевий (насінний) та вегетативний. Ці способи мають свої переваги та недоліки. До недоліків насінневого розмноження слід віднести в першу чергу генетичну строкатість отримуваного посадкового матеріалу і тривалість ювенільного періоду. При вегетативному розмноженні зберігається генотип материнської рослини і скорочується тривалість ювенільного періоду. Проте для більшості видів (в першу чергу для деревних порід) проблема вегетативного розмноження залишається до кінця не вирішеної.

     Це обумовлено наступними причинами:

• не всі породи, навіть на ювенільній стадії, можуть розмножуватися вегетативним способом з необхідною ефективністю (дуб, сосна ялина, горіхоплодні та ін.);
• практично неможливо за допомогою брунькування розмножувати багато видів деревних порід у віці старше 10 – 15 років;
• не завжди вдається отримувати стандартний посадковий матеріал (можливість накопичення і передачі інформації);
• трудомісткістю і складністю операцій при розмноженні дорослих (деревинних) рослин за допомогою щеплень;
• неефективністю розроблених технологій для отримання достатньої кількості генетично однорідного матеріалу протягом року.

     Досягнення  в області культури клітин і тканин призвели до створення принципово нового методу вегетативного розмноження – клонального мікророзмноження (отримання в умовах in vitro (у пробірці), нестатевим шляхом рослин, які генетично ідентичні початковому екземпляру). У основі методу лежить унікальна здатність рослинної клітини реалізовувати властиву їй тотипотентність, тобто під впливом екзогенних дій давати початок цілому рослинному організму. Цей метод має ряд переваг перед існуючими традиційними способами розмноження:

• отримання генетично однорідного посадкового матеріалу;
• звільнення рослин від вірусів за рахунок використання меристемної культури;
• високий коефіцієнт розмноження (10⁵ – 10⁶ – для трав'янистих квіткових рослин, 10⁴ – 10⁵ – для чагарникових деревинних, 10⁴ – для хвойних);
• скорочення тривалості селекційного процесу;
• прискорення переходу рослин від ювенільної до репродуктивної фази розвитку;
• розмноження рослин, які важко розмножуються традиційними способами;
• можливість проведення робіт протягом всьго року і економія площ, необхідних для вирощування посадкового матеріалу;
• можливість автоматизації процесу вирощування.

 

1. Етапи та методи мікроклонального розмноження рослин

 

     Процес  клонального мікророзмноження поділяють на чотири етапи:

• вибір рослини-донора, ізолювання експлантів та отримання стерильної культури;
• мікророзмноження, коли досягається отримання максимальної кількості мікропобігів;
• вкорінення розмножених побігів та пристосування їх до грунтових умов;
• вирощування рослин в умовах теплиці і підготовка їх до реалізації або до висаджування в поле (рис. 1).

     Виходячи  із запропонованих в літературі методів  мікророзмноження рослин цей процес можна здійснювати наступними методами:

• активацією розвитку меристем, що вже існують в рослині;
• індукцією виникнення адвентивних бруньок безпосередньо тканинами експланту;
• індукцією соматичного ембріогенезу;
• диференціацією адвентивних бруньок в первинній та пересадковій калюсній тканині.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Рис. 1 Схема клонального мікророзмноження рослин методом

активації розвитку існуючих меристем (1-ий шлях), індукції

виникнення  адвентивних бруньок на експланті (2-ий шлях):

1 – вибір вихідного експланту; 2 – отримання стерильної культури;

3 – утворення адвентивних бруньок безпосередньо на первинному експланті; 4 – ріст бруньок і формування мікропобігів; 5 – розмноження мікропобігів;     6 – вкорінення мікропобігів; 7 – депонування розмножених рослин -регенерантів при зниженій температурі; 8 – перенесення в тепличні умови;  9 – висадка рослин на полі. 

     Перший  метод, який використовується при клональному мікророзмноженні рослин, – це активація розвитку меристем, які вже існують в рослині, що грунтується на знятті апікального домінування. Це може бути досягнуто двома шляхами:

• видалення верхівкової меристеми стебла і наступне мікробрунькування побігів in vitro на безгормоналому середовищі;
• додавання в поживне середовище речовин цитокінінового типу дії, що індукують розвиток багаточисельних пазушних побігів.

     Як  правило, в якості цитокінінів використовують 6-бензиламінопурин (БАП) або 6-фурфуриламінопурин (кінетин), а також 2-ізопентеніладенін  та зеатин. Отримані таким чином побіги відділяють від первинного материнського експланту і знову самостійно культивують на свіжоприготовленому поживному середовищі, що стимулює проліферацію пазушних меристем і виникнення побігів вищих порядків (рис.2).

       
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Рис. 2 Схема розмноження рослин методом активації існуючих меристем:   

  1 – шляхом видалення верхівкової меристеми; 2 – додаванням в поживне середовище цитокінінів (Б/Г – безгормональне середовище; Ц – цитокініни; А – ауксини)

     На сьогодні цей метод широко використовується у виробництві безвірусного посадкового матеріалу сільськогосподарських культур, як технічних (цукровий буряк, хміль, тютюн, топінамбур), так і овочевих (томати, картопля, огірок, перець, гарбуз та ін.), а також для розмноження культур промислового квітникарства (гвоздика, хризантема, троянда, гербера), тропічних та субтропічних рослин (рододендрон, азалія, камелія, чай та ін.), плодових

 і ягідних культур (яблуня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, агрус та ін.) і деревних рослин (тополя верба, вільха, береза, горобина, секвойя, туя, ялівець та ін.). Для деяких сільськогосподарських культур, таких як картопля, технологія клонального мікророзмноження поставлена на промислову основу.

     Застосування методу активації розвитку існуючих в рослині меристем дозволяє отримувати із однієї меристеми картоплі більше 10⁵ рослин в рік, причому технологія передбачає отримання у пробірках мікробульб – дорогоцінного, безвірусного насіннєвого матеріалу.

     Другий  метод – це індукція виникнення адвентивних бруньок безпосередньо тканинами експланту. Він заснований на здатності ізольованих частин рослини за сприятливих умов поживного середовища відновлювати органи, яких не вистачає, і таким чином регенерувати цілі рослини. Утворення адвентивних бруньок можливо отримати майже з будь-яких органів і тканин рослини (ізольованого зародка, листка, стебла, сім'ядолі, лусочок і донця цибулини, сегментів коріння і зачатків суцвіть), якщо їх вдається отримати вільними від інфекції. Цей процес, як правило, відбувається на поживних середовищах, що містять один цитокінін або в поєднанні з ауксином, що знаходяться в співвідношенні 10:1 або 100:1. В якості ауксина в цьому випадку найчастіше використовують β-індоліл-3-оцтову кислоту (ІОК) або α-нафтилоцтову кислоту (НОК). Це найбільш поширений метод мікророзмноження вищих рослин, яким були розмножені багато цибулинних квіткових рослини (нарциси, лілії, гіацинти, гладіолуси, тюльпани) із цибулинних сегментів базальної частини донця цибулин, експлантів листя; представники роду Brassica (капуста кольорова, качанова, брюссельська, листова, брокколі) – із сегментів гіпокотиля, котиледона, листя; цибуля, часник – з верхівкової меристеми, тканини донця цибулин; томати – з апікальних або пазушних меристем; салат цикорний – із сегментів листових пластинок; петунія – із сегментів коріння; глоксинія, сенполія, стрепто карпус, ештнапсус – із сегментів листових пластинок, а також деякі представники деревинних рослин – з ізольованих зрілих і незрілих зародків.

     Досить  добре розроблена технологія клонального  мікророзмноження суниці, що базується на культивуванні апікальних меристем. Меристематичні верхівки ізолюють з молодих вільних від вірусних хвороб рослин і вирощують на модифікованому поживному середовищі Мурасіге і Скуга, що містить БАП в концентрації 0,1 – 0,5 мг/л. Через 3 – 4 тижні культивування меристема розвивається в паросток, в основі якого формуються адвентивні бруньки, які швидко ростуть і дають початок новим брунькам. Протягом 6 – 8 тижнів утворюється конгломерат бруньок, зв'язаних між собою сполучною тканиною, які знаходяться на різній стадії розвитку. З'являється листя на коротких черешках, в нижній частині яких формуються нові адвентивні бруньки. Ці бруньки розділяють і пересаджують на свіже поживне середовище. На середовищі з цитокініном продовжується проліферація додаткових побігів, а на середовищі без регулювальників росту протягом 4 – 6 тижнів формуються нормальні рослини з корінням і листям. Морфогенетічена активність експланту зберігається протягом 3 – 5 років. Таким чином, від однієї материнської рослини можна отримати декілька мільйонів рослин-регенерантів в рік.

     Безперечний інтерес у дослідників викликає питання, пов'язане із походженням адвентивних бруньок, і зокрема, які клітинні шари беруть участь в диференціації меристем. Єдиної думки з цього питання доки ще немає. Так, Тран Тан Ван в своїх роботах із тканинами тютюну встановила, що саме епідерміс є найбільш активною тканиною, здатною утворювати бруньки, калюс або коріння залежно від гормонального балансу поживиного середовища.

     Цитологічні дослідження, проведені на сегментах базальної частини донця цибулин тюльпанів і нарцисів, показали, що адвентивні побіги формуються з поверхневих шарів меристематичних клітин, прилеглих до донця, а для рослин глоксинії, сенполії та стрептокарпуса процес формування адвентивних бруньок як правило, відбувається в субепідермальних клітинних шарах листових пластинок. Єдиної думки з цього питання також немає і серед дослідників, що працюють з деревними рослинами. Так Арнольд і Еріксон, Джонсон і Борнман вважають, що утворнення бруньок на ізольованій хвої ялини звичайної під дією БАП і β-індоліл-3-оцтової кислоти відбувається в епідермальному шарі культивованого експланту, а Вілалобос та інші стверджують, що при культивуванні сім'ядолі сосни на середовищі, що містить один цитокінін, цей процес відбувається одночасно в епідермальному і субепідермальному шарах.

     Третій  метод, що практикується при клональному мікророзмноженні грунтується на диференціації з соматичних клітин зародкоподібних структур, які своїм зовнішнім виглядом нагадують зиготичні зародки. Цей метод отримав назву соматичний ембріогенез. Основна відмінність утворення зародків in vitro від in vivo (у природних умовах) полягає в тому, що соматичні зародки розвиваються асексуально поза зародковим мішком і своїм зовнішнім виглядом нагадують біполярні структури, в яких одночасно спостерігається розвиток апікальних меристем стебла і кореня. Згідно Стеварду, соматичні зародки проходять три стадії розвитку: глобулярну, серцеподібну, торпедовидну і зрештою мають тенденцію до розвитку в паросток.

     Це  явище вперше було відмічене в культурі клітин моркви ще в середині 50-х рр., а в даний час використовується для розмноження більшості рослин з сімейства Orchidaceae і Rutaceae, а також для деяких представників злакових (пшениця, ячмінь), люцерни, редису, винограду і деяких видів деревинних порід (осика, евкаліпт, дуб, ялина звичайна).

     Формування  емброїдів в культурі тканин відбувається в два етапи. На першому етапі клітини експланту диференціюються за рахунок додавання в поживине середовище ауксинів, як правило, 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) і перетворюються на ембріональних.