Оздоровление посадочного материала в культуре апикальных меристем

         Іншу, значно численнішу групу утворюють довгі та досить гнучкі палички. У представників першої групи крок основної спіралі складає 2,3 – 2,5 нм, тоді як у довших паличок він дорівнює 3,3 – 3,7 нм.

         ВТМ, є найбільш вивченим і найбільш зрозумілим в структурному відношенні нуклеопротеїдом в усій біології. Для цього вірусу характерна надзвичайно стабільна структура. Є дані про те, що він зберігає інфекційність в нестерильних екстрактах при кімнатній температурі протягом 50 років. Стабільність голої РНК ВТМ не більше стабільності будь-якої іншої одноланцюгової РНК. Відповідно, стабільність цього вірусу є наслідком взаємодій між сусідніми білковими субодиницями, а також між білком і РНК.

         Довжина палички  ВТМ була визначена на підставі електронних мікро-фотографій. Довжина ВТМ дорівнює 298 ± 1 нм. Зазвичай довжина палички ВТМ приймається рівною 300 ± 5 нм.

   Вірус тютюну. Часточки вірусу тютюну є жорсткими циліндричними паличками, загальний план будови яких схожий з планом будови ВТМ. Існує багато різних штамів цього вірусу. Діаметр часток дорівнював 25,6 ± 0,3 нм, а крок спіралі складав 2,55 ± 0,03 ім. Радіус центральної порожнини був рівний близько 2,7 нм.

         Вірус штрихової мозаїки  ячменю. Про структуру вірусу штрихової мозаїки ячменю відомо не так багато, як про двох палочкоподібних вірусів, описаних вище. Цей вірус цікавий тим, що зазвичай є палички трьох розмірів - 111, 128 і 148 нм, причому переважають частки завдовжки 128 нм, діаметр яких складає близько 20 нм.

         Х-вірус  картоплі. Часточки цього вірусу мають форму відносно гнучких паличок завдовжки близько 515 нм і шириною 11,5 ± 0,3 нм.

         Y-вірус картоплі. Цей вірус має гнучкі часточки завдовжки близько 730 нм. Ширина палички складає 10,5 ± 0,3 нм, а крок основної спіралі рівний в середньому 3,3 нм.

         S-вірус картоплі. Цей вірус є відносно гнучкою паличкою діаметром близько 15 нм і завдовжки 650 нм. Для представників цієї групи характерний крок основної спіралі, скаладає в середньому близько 3,4 нм.

         Вірус жовтяниці буряка. Часточки цього вірусу мають вигляд дуже довгих гнучких паличок (1250 нм), діаметр яких складає 13,3 ± 0,2 нм. У них є порожнистий центральний канал діаметром близько 3,5 нм. Крок спіралі складає в середньому 3,4 нм і на один виток спіралі доводиться 12 – 14 білкових субодиниць.

         Також досить поширеними вірусами, які уражають рослини є: ВЖМТ, вірус крапки кінських бобів, вірус огіркової мозаїки, вірус хлоротичної крапки коров'ячого гороху, вірус некрозу тютюну, вірус-сателіт, вірус мозаїки люцерни, вірус карликовості рису, вірус бронзовості томатів, вірус жовтої карликовості картоплі, вірус некротичного пожовтіння салату-латуку, вірус гомфрени, вірус мозаїки кукурудзи, вірус смугастої мозаїки пшениці та ін. 

1.2.2 Отримання безвірусного матеріалу в природніх умовах 

     Іноді на якійсь певній ділянці можна виявити  окремі рослини певного сорту, не заражені вірусом. Якщо здорових рослин знайти не вдається, то іноді можна скористатися тією обставиною, що вірус розподіляється по рослині нерівномірно. Особливо це відноситься до деяких вірусів, що уражають плодові дерева. У таких випадках з незаражених частин дерева беруть бруньки. Іноді вірус, який системно поширюється по всій рослині, не встигає проникнути в кінчики побігів швидкорослих стебел. Саме завдяки цьому, Холмсу, вдалося отримати рослини жоржини, вільні від вірусу томатів. Відповідна процедура успішно використовується при роботі з деякими вірусами і певними рослинами-господарями. Проте багато рослин, що розмножуються вегетативним шляхом, уражено тим або іншим вірусом практично на 100 %. В цих випадках, для того, щоб отримати здоровий початковий матеріал, слід користуватися яким-небудь із спеціальних методів, описаних нижче. 

     1.2.3 Метод теплової  терапії 

       Метод термотерапії застосовується як в умовах in vivo, так in vitro і передбачає використання сухого гарячого повітря. Для пояснення, механізму звільнення рослин від вірусів в процесі термотерапії існують різні гіпотези. Згідно одній з них високі температури впливають безпосередньо на вірусні частки через їх рибонуклеїнову кислоту і білкову оболонку, викликаючи фізичне руйнування і позбавляючи вірусні частки інфекційності. Друга гіпотеза полягає в тому, що висока температура діє на віруси через метаболізм рослин. Під впливом високих температур порушується рівновага між синтезом і деградацією вірусних часток. Якщо переважає синтез, то концентрація вірусу в заражених тканинах зростає і навпаки.

     Нагрівання – найбільш поширений метод з числа тих, які застосовуються для звільнення рослинного матеріалу від вірусів. Холлінс перераховує близько 90 вірусів, від яких вдалося звільнити методом прогрівання принаймні один вид рослини-господаря.

     Рослини, що піддаються термотерапії, поміщають  в спеціальні термокамери, де протягом першого тижня підвищують температуру  від 25 до 37 °С шляхом щоденного збільшення температурного параметру на 2°С. Не менше важливо при термотерапії створювати і підтримувати впродовж всього процесу оптимальні режими: температуру 37°С, освітленість лампами денного світла 5 тис. лк, фотоперіод 14 – 16 год в добу при відносній вологості повітря в термокамері 90%.

     Тривалість  термотерапії цілком залежить від складу вірусів та їх термостійкості. Якщо, наприклад, для гвоздики досить 10 – 12-тижневої дії теплом, то для знезараження хризантем від Б-вірусу цей період триває 12 і більше тижнів. Проте існують рослини, наприклад, цибулинні культури, цимбідіум, троянди та інші, ріст яких пригнічується в результаті тривалої термотерапії in vitro. Для таких рослин доцільно проводити термотерапію рослин-регенерантів in vitro.

     Тепловій  обробці можна піддавати два  різні види рослинного матеріалу. Частини  рослин (бульби, деревні бруньки), зазвичай витримують вищі температури, ніж зростаючі  тканини; ефект обробки в цьому  випадку, ймовірно, пов’язаний з прямою інактивацією вірусу. Температурні режими і тривалості обробки варіюють дуже широко (від 35 до 54°С, від декількох хвилин до декількох годин). Часто для прогрівання використовують гарячу воду, оскільки при короткочасній обробці гарячим повітрям рослинний матеріал, як правило, рівномірно не прогрівається. Якщо тканини не повністю гідратовані, то обробка сухим теплом значно менш ефективна, чим обробка гарячою водою.

     Набагато  частіше тепловій обробці піддають зростаючі тканини. При цьому, як правило, застосовують обробку гарячим повітрям, а не гарячою водою. Прогрівання зазвичай проводиться протягом декількох тижнів при температурі 35 – 40°С. Така обробка забезпечує найбільш високу витривалість рослинного матеріалу. Умови проведення теплової обробки варіюють дуже широко і підбираються емпірично для кожної комбінації вірус-рослина.

     Дуже  часто відразу ж після прогрівання  від оброблених побігів ввіділяють самий кінчик верхівки, оскільки цей  кінчик іноді вже не містить вірусу, тоді як інша частина побігу ще залишається  інфекційною.

     Від деяких стабільних вірусів, таких, як ВТМ, не можна звільнитися нагріванням рослинної тканини. Нині не існує певних критеріїв, щоб сказати заздалегідь, чи може рослина того або іншого виду бути у такий спосіб звільненою від якогось певного вірусу або ж немає. Поки що не ясно, які механізми лежать в основі звільнення тканини від вірусу: ймовірно, вони включають і інактивацію вже синтезованого інтактного вірусу і порушення репродукції вірусу.

     У випадку стабільних вірусів, таких, як Х-вірус картоплі, окремі частини  рослини можна звільнити від  інфекції, витримуючи рослину протягом декількох місяців при порівняно  низьких температурах (близько 35 °С). Меллор і Стейс-Сміт вказали, що дуже важливо починати таку обробку осінню або зимою, щоб встигнути закінчити  її до початку вегетації. Їм вдавалося  звільнитися відразу від двох вірусів картоплі, а саме від Х- і Y-вірусу, вирощуючи рослини картоплі протягом декількох місяців при   33 – 37 °С, після чого пазушні бруньки (завдовжки 0,3 – 1,0 мм) відділяли від рослини і вирощували на поживному середовищі.

     Окрім позитивної дії термотерапії на звільнення рослин від вірусів, виявлений позитивний ефект високих температур на точку росту і процеси морфогенезу деяких квіткових культур (гвоздика, хризантема, фрезія) в умовах in vitro. Застосування термотерапії дозволяє збільшити коефіцієнт розмноження на 50 – 60 %, підвищити адаптацію пробіркових рослин-регенерантів до грунтових умов, а також отримати вищий відсоток безвірусних маткових рослин. 

     1.2.4 Метод культури  апікальних меристем 

       Культивування апікальної меристеми  виявилося дуже ефективним методом  звільнення рослин, що вегетативно  розмножуються, від деяких вірусів.  Холлінгс показав, що в культурі апікальної меристеми стерильним залишається конус наростання і перша пара листових зачатків. У різних рослин довжина цієї ділянки коливається від 0,1 до 0,5 мм, тоді як довжина кінчика верхівки, відокремлюваного після прогрівання, зазвичай складає 0,5 – 2 см. Мінімальний розмір апікальної ділянки, з якої можна виростити цілу рослину, у різних видів різний. Для регенерації цілої рослини у багатьох випадках необхідно (принаймні при існуючих методах культури тканини), щоб культивуєма ділянка меристеми включала хоча би один листовий зачаток.

     Різні дослідники використовують для культивування  апікальної меристеми самі різні поживні середовища. Основні інгредієнти такого середовища – відповідні мінеральні солі (макро- і мікроелементи), сахароза і один або декілька стимуляторів росту (наприклад, індолілоцтова кислота); іноді культуру вирощують на агарі.

     З частини апікальної меристеми може вирости рослина, вільна від вірусу. Відколи Морел в 1948 р. запропонував цей метод, він став широко використовуватися. Комерційні сорти ревеню вдалося звільнити від п'яти вірусів, якими вони зазвичай бувають заражені. Метод культивування апікальної меристеми успішно застосовується в роботі з тими рослинами, які не витримують теплової обробки. Іноді цей метод дає позитивні результати у поєднанні з тепловою обрбкою; при цьому використовується апікальна меристема прогрітих рослин. У боротьбі з тими вірусами, від яких важко звільнитися, можна використовувати інгібітори, які пригнічують розмноження вірусу. Їх вводять в поживне середовище. Квок для звільнення картоплі від Х- і S-вірусів вводив в середовище 2,4-Д. Кассаіс і Тіслі подібним чином використовували 2-тіоурацил для знищення Y-вірусу картоплі.

     Тільки  частина культур апікальної меристеми дає рослини, вільні від вірусу. Нині не ясно, від чого залежить успіх при використанні цього методу. Можна уявити декілька різних ситуацій: 1) хоча зазвичай вірус в меристематичній тканині відсутній, окремі зразки тканини можуть бути забруднені ним; 2) деякі частини меристем можуть містити вірус, а інші – ні; 3) вірус, який пристосовується в меристемі, інактивується в процесі культивування на штучному середовищі. Застосовуючи метод культивування апікальної меристеми, дуже важливо пам'ятати, що рослини, які вирощені з меристеми і на вигляд здаються здоровими, повинні перед використанням протягом певного часу піддаватися перевірці. На ранній стадії ознаки захворювання проявляються не завжди; проте після тривалої інкубації в деяких випадках спостерігається розвиток інфекції. 

     1.2.5 Метод дії знижених  температур та  метод хіміотерапії 

     Дія знижених температур. Вплив інкубації рослин при знижених температурах на витривалість вірусів вивчений ще недостатньо. Можна чекати, що низькі температури не виявляють певну значну дію на віруси, які стабільні in vitro. В деяких випадках вирощування при знижених температурах призводило до звільнення рослинного матеріалу від вірусів. Селскі та Блек вирощували при 14 °С відведення рослин денця, заражених вірусом раневих пухлин. У цих умовах навіть після декількох вегетативних поколінь розвитку пухлин не спостерігалося. Відведення рослин третього покоління зрізали і вирощували в теплиці в звичайних умовах. 95 % цих рослин при вирощуванні в теплиці дали відведення другого (тепличного) покоління, які, як показала відсутність пухлин, були на 90 % вільні від вірусу. Механізм дії зниженої температури невідомий. Можливо, ця дія обумовлена зниженням швидкості репродукції вірусу і (чи) швидкості його пересування (у результаті чого частина рослини виявляється вільною від вірусу). Знижені температури можуть пригнічувати розвиток пухлин і тим самим значною мірою скорочувати кількість вірусу, яка могла б синтезуватися і поширитися рослиною.

     Хіміотерапія. Метод полягає в додаванні до поживного середовища, на якому культивують апікальні меристеми, аналога гуанозину – Ір-Д-рибофуранозил-1, 2,4-триазол-3-карбоксимід (комерційна назва вірозол) концентрацією 20 – 50 мг/л. Це противірусний препарат широкого спектру дії. При використанні вірозолу в культуральному середовищі відсоток безвірусних меристемних рослин для ряду звичайних для цих рослин вірусів збільшувався до 80 – 100 % при 0 – 41 % в контролі. Позитивні результати хемотерапії були отримані для сливи, черешні, малини, деяких квіткових та інших рослин.