Современные методы исследования микробной клетки

13. Методы молекулярно-генетического  анализа

Изучение генома микроорганизмов  осуществляют с помощью методов  молекулярно-генетического анализа. Известные в наше время методы этого анализа характеризуются  сложностью, высокой чувствительностью  и точностью.

Основным способом генетического анализа считают метод молекулярной гибридизации. Сущность способа заключается во взаимодействии комплементарных цепей ДНК или РНК, в результате которого образуются двунитчатые структуры. Гибридизация может осуществляться между комплементарными молекулами ДНК и ДНК, ДНК и РНК, РНК и РНК. Гибридизация осуществляют поэтапно. Сначала деспирализуют генетический материал с целью получения одноцепочных структур, затем адсорбируют его на нитроцеллюлозной мембране. Следующим этапом является обработка материала зондом, который представляет собой короткую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарной исследуемой кислоте и меченную радиоактивным фосфором. После обработки материала зондом, исследуемые пробы помещают в специальный счетчик. Искомую последовательность нуклеиновой кислоты в материале определяют по степени радиоактивности пробы. Метод высокочувствителен, т. к. позволяет выявить до 10^-10 г. нуклеиновой кислоты в 1 г. материала.

В начале 80-х годов К. Мюллисом был разработан способ под названием полимеразная цепная реакция (ПЦР). Суть этого метода сводится к следующему. Исследуемый материал нагревают до 90-100 єС, что приводит к раскручиванию 2-х цепочной ДНК на отдельные цепи. После расхождения цепей ДНК, к ним добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют (накапливают). Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. В результате синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяют снова и снова. При каждом повторе цикла количество ДНК гена будет увеличиваться в 2 раза. Для проведения реакции необходимы специальные приборы - амплификаторы.

Этот метод позволяет  обнаружить 100 молекул ДНК или  РНК в 1 г. исследуемого материала, т. е. является самым высокочувствительным методом из всех известных в настоящее  время.

ПЦР применяют для диагностики  вирусных и бактериальных инфекций, анализ рекомбинаций фагов

Естественно, что гибридизация фагов, происходящая в период их внутриклеточного размножения, не может быть обнаружена, если клетка заражается фаговыми частицами  одного генотипа. Не обнаруживается она  и при смешанном заражении  мутантом и нормальным фагом, так как гибридизация может быть выявлена лишь по рекомбинации признаков фагов двух генотипов. Накопление различных мутантных линий фагов оказалось необходимой предпосылкой проведения гибридизационной работы с фагами.

Очевидно, что для изоляции рекомбинантов необходимо различие между исходными формами минимум по двум признакам. Такой опыт был впервые проведен с фагом Т2 при смешанном заражении клеток Echerichia coli мутантами hR и Hr. В потомстве фагов, освобожденном при лизисе клеток, были обнаружены частицы дикого типа (Т2 НR)^I и двойного мутанта. Появление таких рекомбинантных генотипов говорило о том, что при размножении фаговых частиц двух генотипов в одной бактерии происходит в той или иной форме гибридизации.

Для генетика возможно при обнаружении рекомбинантов количественно оценить частоту, с которой они появляются.

Рассмотрим скрещивание  у фага Т4 между тройным мутантом (m r tu) и фагом дикого типа (M R Tu). В  потомстве от смешанного заражения  такими фагами наблюдались частицы  восьми генотипов - следовательно, все рассматриваемые гены рекомбинируют. Если бы они рекомбинировали свободно, то все восемь классов в потомстве появились бы с равной численностью. В действительности же резко преобладают родительские типы (m r tu и M R Tu). Так, в одном опыте среди 10342 колоний было найдено родительских генотипов: m r tu - 3467, M R Tu - 3729; рекомбинантных: m R Tu - 520, M r tu - 474, m r Tu - 853, M R tu - 965, m R tu - 162, M r Tu - 172. Помимо преобладания родительских генотипов в потомстве, обращает на себя внимание и приблизительное равенство численностей взаимодополняющих рекомбинантных классов (например, m R Tu и M r tu), т.е. картина расщепления выглядит также, как картина расщепления в мейозе тригетерозиготы по специальным генам у любого высшего организма. Если это так, то можно по законам расщепления вычислить частоту встречаемости рекомбинантов.

Определим частоту рекомбинации для пары генов m и r, т.е. отношение  числа рекомбинантов по этим генам  к общему числу потомков:

(520+474+162+172) / 10342 =0,129

для пары r и tu частота  рекомбинации будет равна 0,208, а для  пары m и tu - 0,271. из этих результатов  следует, что все три гена сцеплены и могут быть линейно расположены  в порядке m-r-tu. Понятно, что найденная  частота рекомбинации пары m и tu занижена, так как при ее определении не были учтены двойные обмены (генотипы m R tu и M r Tu).

Итак, генетический анализ рекомбинации у фагов может  проводиться также, как и в  генетике высших организмов. Анализ разнообразных  скрещиваний у фага T4 показал, что все изученные гены фага могут быть расположены в линейном порядке в одной группе сцепления, причем расстояние между генами измеряются частотой рекомбинации их в потомстве. Такие же результаты были получены и для других фагов.

Гибридологический анализ при трансдукции.

Анализ аллельности  с использованием абортивной трансдукции  был выполнен в отношении различных  мутаций у (Salmonella thyphimurium). Обнаружилось, что мутации потребности в  триптофане распадаются на 4 группы: tru A, tru B, tru C, tru D, соответствующие 4 генам. При трансдукции между мутантами одной группы не наблюдается появления крошечных колоний. При трансдукции между мутантами разных групп крошечных колоний появляется столько же, как и тогда, когда донором служат бактерии дикого типа. Поскольку фаг переносит небольшие фрагменты бактериальной хромосомы. То путем трандукции невозможно обнаружить сцепление и провести картирование удаленных друг от друга генов в бактериальной хромосоме. Если же два гена близко располагаются друг к другу, то они могут попадать в один хромосомный фрагмент, переносимый фагом, обнаруживая явление сцепленной трансдукции. Оно оказывается во многом сходным с разбиравшимся ранее явлением сцепленной трансформации.

Генная инженерия

Под генной (генетической) инженерией подразумевают целый комплекс технологий, методов, процессов, посредством которых получают рекомбинантные (созданные благодаря биотехнологии на основе ДНК) РНК и ДНК, а также гены из клеток организмов, осуществляют различные манипуляции с генами и вводят их в другие организмы. Генная инженерия не является наукой – это только набор инструментов, использующий современные достижения клеточной и молекулярной биологии, генетики, микробиологии и вирусологии.

Работы по изменению существующих органических форм стали возможны только после того, как в 1953 году была расшифрована молекула ДНК. Человек наконец понял сущность гена, его значение для белков, прочитал код геномов живых организмов и естественно не стал останавливаться на достигнутом. В душах людей возникло сильное желание «творить» животный и растительный мир планеты по своему усмотрению.

С поразительной настойчивостью и  упорством человек стал добиваться поставленной цели и к концу первого  десятилетия XXI века достиг очень многого. Он научился выделять ген из организма  и синтезировать его в лабораторных условиях; освоил технологии видоизменения гена для придания ему нужной структуры; нашёл способы введения в ядро клетки преобразованного гена и присоединения его к существующим генетическим образованиям.

Это сложнейшие технологии: они не имеют аналогов в окружающем мире. Ведь ген, молекула ДНК, ядро клетки представляют из себя микроскопические объекты, к которым невозможно подступиться со скальпелем, пинцетом или каким либо другим инструментом. Даже подковать блоху в тысячу раз легче, чем произвести определённые манипуляции, скажем, с тем же самым геномом.

Всё это стало возможно благодаря  ферментам – образованиям на основе белка, отвечающим за организацию работы клетки. В частности можно назвать  такие ферменты, как рестриктазы. Одна из их функций – защита клетки от инородных генов. Чужая ДНК разрезается этим надёжным стражем на отдельные части, причём существует множество различных рестриктаз, каждая из которых наносит удар в строго определённом месте.

Подобрав набор таких ферментов, можно без труда расчленять молекулу на требуемые участки. Затем необходимо их соединить, но уже по новому. Тут помогает природное свойство генетического материала воссоединяться друг с другом. Помощь в этом оказывают также ферменты лигазы, задача которых заключается именно в соединении двух молекул с образованием новой химической связи.

Непохожий ни на что гибрид создан. Представляет он из себя молекулу ДНК, несущую новую генетическую информации. Такое образование в генной инженерии  называют вектором. Его главная задача – передача новой программы воспроизводства намеченному для этой цели живому организму. Но ведь последний может её проигнорировать, отторгнуть и руководствоваться только родными генетическими программами.

Такое невозможно, благодаря явлению, которое носит название трансформация у бактерий и трансфекция у человека и животных. Суть его заключается в том, что если клетка организма поглотила свободную молекулу ДНК из окружающей среды, то она всегда встраивает её в геном. Это влечёт за собой появление у такой клетки новых наследственных признаков, запрограммированных в поглощённую ДНК.

Поэтому, чтобы новая генетическая программа начала работать, необходимо только одно, - чтобы она оказалась  в нужной клетке. Это сделать не просто, так как такое сложное  образование, как клетка, имеет множество защитных механизмов, препятствующих проникновению в неё чужеродных объектов.

Любые преграды можно обойти. Для  начала маленькие – к примеру, введение чужеродных генов в бактерии. Здесь, в качестве вектора, вполне можно  использовать плазмиду – кольцевую молекула ДНК малых размеров, располагающуюся в клетках вне хромосом и несущую дополнительные половые признаки. Бактерии постоянно обмениваются плазмидами, поэтому не составляет никакого труда перепрограммировать указанную молекулу и направить в клетку.

Значительно более трудно ввести готовый  ген в наследственный аппарат  клеток растений и животных. Здесь  на помощь приходят вирусы – генетические элементы, одетые в белковую оболочку и способные переходить из одной  клетки в другую. Для такой работы прекрасно подходят молекулы ДНК вирусов - фаги. Их «переделывают» под нужные параметры и включают в генетический аппарат животного или растительного организма.

Всё, дело сделано. Внедрённый генетический код начинает работать. Иногда бывают сбои, если часть генов новой ДНК окажутся «молчащими». Таких много в каждом организме. У одних живых существ они прекрасно функционируют, у других же не проявляют себя никак. Видимо прекращают свою деятельность при утере той или иной особью каких-то качеств в процессе эволюции.

Накладки и недоработки учитываются  и тщательно анализируются. Непрерывно идут работы, изучающие различные  комбинации генов: удаление части их из молекулы или наоборот - добавление составляющих, совсем не свойственных данному живому организму.

Рассматриваются вопросы корректировки механизмов, отвечающих за процесс преобразования наследственной информации ДНК в такой функциональный продукт, как РНК или белок. Всё это обеспечивает высокую эффективность и качество конечных результатов по генетической модернизации окружающего мира.

В наши дни успехи и достижения видны невооружённым глазом. Если рассмотреть такую сферу человеческой деятельности, как сельское хозяйство, то здесь генная инженерия добилась самых впечатляющих результатов.

С начала 80-х годов получено множество геномодифицированных сортов зерновых культур. На конец первого десятилетия XXI века ими засеяно 120 млн. га. земельных угодий по всему миру. Отмечен высочайший уровень урожайности, его потрясающая устойчивость к неблагоприятным климатическим условиям и полное отсутствие паразитов, пожирающих необходимые для людей злаки.

Выведены невиданные раньше сорта  картофеля, кукурузы, сои, риса, рапса, огурцов. Количество видов растений, к которым успешно применены  методы генной инженерии, превышает  цифру 50. Трансгенные плоды имеют более длительный срок созревания, чем обычные культуры. Этот фактор прекрасно сказывается при транспортировке, когда не надо бояться, что продукт перезреет.

Отпадает надобность в селекции, с её ограниченными возможностями  получения гибридов только от одних и тех же организмов. Генная инженерия может скрещивать помидоры с картошкой, огурцы с луком, виноград с арбузами – возможности здесь просто потрясающие. Размеры и аппетитный свежий вид полученного продукта могут приятно удивить любого.

Скоро прикажут долго жить химические средства борьбы с вредными насекомыми. Слова инсектициды, акарициды, пестициды  будут надёжно забыты, так как  внедрённые в растительную клетку овоща, фрукта или зерновой культуры молекулы ДНК, определённых видов бактерий, уничтожат и колорадского жука, и хлопковую совку, и листовёртку, и многих-многих других вредителей сельскохозяйственных угодий. Это сэкономит огромные средства на опыление полей, резко снизит другие затраты и соответственно понизит себестоимость конечного продукта.

 
Достижения генной инженерии

Животноводство также находится  в зоне интересов генной инженерии. Исследования по созданию трансгенных  овец, свиней, коров, кроликов, уток, гусей, кур считаются в наши дни приоритетными. Здесь большое внимание уделяется именно животным, которые могли бы синтезировать лекарственные препараты: инсулин, гормоны, интерферон, аминокислоты.

Так генетически модифицированные коровы и козы могли бы давать молоко, в котором содержались бы необходимые составляющие для лечения такого страшного заболевания, как гемофилия. Инсулин, антитрипсин тоже можно получать из питательной белой жидкости. Не надо забывать и о стоимости. Создание такого типа биологических лекарств обойдётся раз в 20 дешевле, чем производство соответствующих медикаментов при помощи традиционной химии.

Успешно ведутся работы по регулированию  обмена веществ, от которого напрямую зависит продуктивность. В овцеводстве вполне реально создать животных, предрасположенных к быстрому росту шерсти. Массовое выведение более крупных пород свиней – дело ближайших лет. То же касается и домашней птицы.