Современные методы исследования микробной клетки

Мутации фенотипически  проявляются изменением морфологических, биохимических, вирулентных и других свойств.

Диссоциация - это  особый, присущий только бактериям  вариант изменчивости, при котором  происходит культуральная изменчивость, т. е. расщепление вида и возникновение при росте на плотной питательной среде двух основных типов колоний: S-форма - гладкие (от английского smooth - гладкий) и R-форма (от английского rough - шероховатый) - шероховатые. Между этими формами имеются и переходные М-, О-, Д-формы.

Микроорганизмы  из колоний в S-форме обладают хорошо выраженными антигенными и вирулентными свойствами и, напротив, у бактерий из колоний в R-форме эти свойства выражены слабо. Однако, не всегда S-форма  микробов является свидетельством их вирулентности. Например, возбудитель сибирской язвы, туберкулеза, чумы вирулентны в R-форме.

В основе диссоциации  лежат мутации, спонтанно возникающие  в естественной среде обитания микробов или же при культивировании их на искусственных питательных средах.

Диссоциация имеет  большое значение для микроорганизмов, так как они, благодаря этому  явлению, получают селективное преимущество, обеспечивающее их существование в  организме животных и человека, а  также во внешней среде. Известно, что S-формы более устойчивы к фагоцитозу, R-формы - к факторам естественной среды обитания.

Геном бактерий способен к репарации. Репарация - это  процесс восстановления структуры  поврежденной ДНК, который обеспечивается многочисленными ферментами, определяющими состояние этой кислоты. Например, фоторепарация зависит от фотолиаз. Эти ферменты активизируются при образовании тиминовых димеров в ДНК под воздействием ультрофиолетового облучения и деполизируют эти димеры до исходных мономеров.

Наибольшее значение в жизнедеятельности микроорганизмов имеет SOS-репарация или SOS-ответ. SOS-ответ - это реакция микробных клеток на прекращение синтеза нуклеиновых кислот в связи с повреждением ДНК, голоданием клетки, воздействием продуктов метаболизма и т. д. SOS-ответ возникает при критическом состоянии клетки, на грани ее гибели, как реакция направленная на восстановление жизнедеятельности клетки. Например, результатом SOS-ответа у E. Coli является синтез около 25 белков, имеющих непосредственное отношение к репарации, рекомбинации и синтезу ДНК. SOS-ответ у микроорганизмов контролируется SOS-областью. Обычно гены этой области находятся в неактивном состоянии и активизируются лишь в критические для жизни клетки моменты. SOS-репарация обеспечивает развитие микробной популяции в целом и ее адаптацию к изменившимся внешним условиям.

Кроме мутаций  у бактерий известны рекомбинационная изменчивость. Рекомбинация - это передача генетического материала от клетки-донора с одним генотипом к клетке-реципиенту с другим генотипом. В результате такой передачи образуются рекомбинанты - т. е. бактерии, обладающие свойствами обоих родителей. Рекомбинация является важнейшим фактором эволюции, т. к. между разными особями происходит обмен генетической информацией, что повышает уровень их приспосабливаемости к различным внешним факторам окружающей среды. Рекомбинации могут наблюдаться на уровне любых живых организмов - от прокариот до высших эукариот.

Различают следующие  способы рекомбинационной (комбинативной) изменчивости: трансформация, трансдукция, конъюгация.

Трансформация (от латинского transformo - превращать, преобразовывать) - изменение генома бактерий - реципиента, в результате поглощения из среды  свободного фрагмента ДНК клетки-донора.

Впервые явление  трансформации начал изучать Ф. Гриффитс (1928), используя в опытах культуры пневмококков. Эти микроорганизмы способны к диссоциации и образуют на плотной питательной среде колонии в S-форме и R-форме. Микроорганизмы образующие S-формы колоний капсульные, они патогенны для белых мышей. Бактерии, формирующие на агаре R-формы колоний бескапсульные, не патогенные для мышей. Фактором патогенности у пневмококков является капсула, что было учтено Ф. Гриффитсом при проведении опытов. Он ввел мышам вместе две культуры пневмококков: одну - непатогенную бескапсульную (R-штамм), а вторую - патогенную с капсулой (S-штамм), но обезвреженную нагреванием. Мыши, получившие смесь упомянутых культур пали. Из крови павших мышей была получена культура, микроорганизмы которой имели капсулу и обладали патогенностью. Контрольные эксперименты продемонстрировали, что введение мышам по отдельности живых пневмококков бескапсульных и убитых нагреванием не приводит к гибели животных. Ученый сделал вывод, что непатогенные клетки R-штамма могут рансформироваться в патогенные пневмококки, обладающие капсулой.

Грачевой (1946) был  получен вариант кишечной палочки  с некоторыми свойствами характерными для сальмонелл. Она культивировала E. Coli на среде, к которой добавлялась  убитая культура сальмонелл.

В результате многочисленных экспериментов было установлено, что путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: синтез капсульного полисахарида, синтез различных ферментов, устойчивость к антибиотикам и т. д.

Было обнаружено, что трансформация имеет место  чаще в пределах одного вида, но может наблюдаться и между разными видами. В процессе трансформации участвуют две бактериальные клетки: донор и реципиент.

О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти (1944) установили, что трансформирующим фактором является ДНК. По их мнению, трансформация представляет собой поглощение изолированной ДНК бактерии донора клетками бактерии реципиента.

Трансформация - сложный биологический процесс, который протекает поэтапно. Первая стадия этого процесса заключается  в адсорбции трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки. Вторая - проникновение ДНК через определенные рецепторные участки стенки бактерии-реципиента при помощи специальных белков внутрь клетки. Третья стадия представляет собой спаривание части ДНК донора с ДНК реципиента, четвертая - включение в ДНК реципиента одной из цепей трансформирующего элемента. И пятая - изменение нуклеотида клетки-реципиента в ходе ее последовательных делений. Способность бактерий реципиентов к трансформации была названа компентентностью. Компентентность определяется физиологическим состоянием клетки-реципиента к периодам клеточного цикла.

Трансдукция (от латинского transductio - перенос) - перенос  генов из одной бактериальной  клетки в другую при помощи бактериофага. Явление трансдукции впервые  установили Н. Циндлер и ДЖ. Ледербер (1952). Для исследований они использовали патогенные для белых мышей два штамма S. typhimurium (22 A и 2A). Штамм 22 А - ауксотрофный, не способный синтезировать триптофан (Т^-), штамм 2А - способный к синтезу триптофана (Т⁺). В опытах исследователи использовали U-образную трубку, разделенные на изгибе бактериальным фильтром. В одно колено этой трубки с питательной средой засевали бактерии штамма 22 А, в другое - штамма 2А. Опыты показали, что штамм 22 А был лизогенен по фагу Р-22. Этот фаг из лизогенной культуры проходил через бактериальный фильтр, лизировал бактерии штамма 2А, присоединял при этом его генетический материал. Затем фаг возвращался обратно и передавал генетический материал штамма 2А штамму 22А, который приобретал способность синтезировать триптофан.

Явление трансдукции  установлено не только у сальмонелл, но и у кишечной палочки и актиномицетов. У бактерий наблюдается трансдукция  одного, реже двух и весьма редко  трех сцепленных генов.

Различают следующие  виды трансдукции: общую (неспецифическую), специфическую и абортивную.

Общая трансдукция  характеризуется тем, что фаг  играет роль переносчика генетического  материала бактерий, т. е. передает в  клетку-реципиент любой ген донорской  клетки. Сам фаг в нуклеоид реципиента не встраивается и лизогении бактериальной культуры не происходит. Один и тот же фаг может служить трансдуктором различных признаков: ферментативной активности, устойчивости к лекарственным веществам, подвижности, вирулентности и др.

Специфическая трансдукция заключается в том, что бактериофаг переносит от клетки-донора в клетку-реципиента строго определенные гены и встраивает их в определенные участки реципиента. Бактериофаг может встраиваться в нуклеоид клетки-реципиента. Клетки бактерий, имеющие в своей хромосоме профаг, называют мезогенными, а явление совместного существования ДНК бактерий и профага называется мезогенным.

Абортивная  трансдукция характеризуется тем, что фрагмент ДНК донора, перенесенный в клетку реципиента не включается в ее нуклеоид, а может сохраняться в цитоплазме клетки. Клетка при этом не подвергается лизису, но при делении ее перенесенный новый признак постепенно исчезает у ее потомства.

Конъюгация (от латинского conjugatio - контактирование) - перенос генетического материала  от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) при непосредственном контакте этих клеток. Явление конъюгации открыли Дж. Ледерберг и Э. Татуш (1946).

Ученые взяли  два ауксотрофных мутантных штамма E. Coli к-12: один не способный синтезировать треонин и лейцин (Thr-Leu^-), другой - метионин и биотин (Met-Bio^-) и выращивали их вместе в течение 12 часов на полноценной питательной среде. Затем выросшую культуру отцентрифугировали и отмыли от полноценной питательной среды и засеяли на минимальную питательную среду.

На этой среде  без метионина, биотина, треонина и  лейцина появились прототрофные колонии Met⁺, Bio⁺, Thr⁺, Leu⁺. Опытным путем ученые установили, что ни трансформации, ни трансдукции в данном случае не наблюдалось. Был сделан вывод о происхождении рекомбинантных геномов в результате непосредственного контакта родительских клеток. Микрофотографии конъюгирующих клеток явились доказательством того, что между ними образуется цитоплазматический мостик.

В 1952 году Хейтс  выяснил, что при конъюгации одна клетка является мужским донором, а другая - женским реципиентом. Клетки-доноры обладают половым фактором F ( от fertility - плодовитость), который представляет собой замкнутую в кольцо молекулу ДНК. Перенос генетического материала происходит в одном направлении - от донорской (мужской F⁺) клетки к реципиентной (женской F^-).

Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды, продуцирующей  половые пили, образующие трубочку, по которой плазмидная ДНК передается из клетки-донора в клетку-реципиент, в результате чего последняя приобретает донорские свойства. В случае, когда F-фактор встраивается в хромосому донора и функционирует в виде единого с ней репликона, то нуклеоид донора приобретает способность передаваться в клетку-реципиент. Донорские клетки, содержащие встроенный в нуклеоид F-фактор, называются Hfr-клетками ( от английского high frequency of recombination - высокая частота рекомбинаций).

Процессы генетической рекомбинации у бактерий (трансформация, трансдукция, конъюгация) различны по форме, но аналогичны по содержанию, т. к. в результате каждого процесса происходит перенос фрагмента ДНК от одной клетки к другой. При трансформации бактерии-реципиенту передается свободная ДНК, при трансдукции перенос участка ДНК осуществляется при помощи бактериофага, а при конъюгации транспортировка участка ДНК происходит через цитоплазматический мостик между бактериями.

12. Особенности  генетики вирусов

Геном вирусов  содержит один тип нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты, как носители генетической информации вирусов, могут быть однонитчатыми или двунитчатыми. Репликация генома вирусов зависит от строения нуклеиновой кислоты, процесс транскрипции осуществляется многочисленными путями.

ДНК-содержащие вирусы размножаются в ядрах эукариотических клеток, используя для транскрипции клеточную полимеразу. В качестве примера являются вирусы герпеса, аденовирусы. В случае репликации вируса в цитоплазме клеток, он использует в процессе трансдукции индивидуальные ферменты.

РНК-овые вирусы могут быть плюс-нитевыми (РНК⁺) и имнус-нитевыми (РНК^-).

Трансляция у плюс-нитевых  вирусов (пикорновирусы, флавивирусы  и др.) начинается непосредственно  с исходной РНК. Процесс трансляции у минус-нитевых вирусов не может  осуществляться на прямую. Этим вирусам необходим предварительный синтез комплементарной копии РНК, который осуществляется особым специфическим ферментом (РНК-зависимой РНК-полимеразой).

У РНК-овых двунитчатых вирусов  плюс-нить не используется. Эти вирусы в своем жизненном цикле используют минус-цепь РНК, как все минус-нитевые вирусы.

Представители семейства Retroviridae обладают плюс-нитевым вирусным геномом, но не смотря на это генетическая информация у них снаяала переписывается на ДНК, т. е. по РНК вируса образуется комплементарная цепь ДНК. Течение этого процесса реализуется благодаря РНК-зависимой ДНК полимеразы (ревертазы). Образующаяся ДНК интегрирует с геномом клетки. У вирусов семейства Retroviridae транскрипцию встроенной ДНК обеспечивают РНК-полимеразы клеток эукариот.

Подобно бактериям, вирусы подвержены генотипической и фенотипической изменчивости.

При заражении эукариотических  клеток ассоциацией вирусов наблюдаются  различные типы взаимодействия между  ними.

Пересортировка генов  связана с перестройкой у вирусов, имеющих сегментированный геном. Так, рекомбинанты вируса гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейтролинидазы. В результате происходит быстрое изменение свойств вирусов и возникает новый тип вируса.

Множественная реактивация возникает при заражении  клетки несколькими вирусами с дефективными геномами. Если повреждения генома различны у разных вирусов, то вирус  может репродуцироваться, т. е. вирусы с поражением разных генов дополняют  друг друга за счет рекомбинации геномов.

Перекрестная реактивация  возникает в случае заражения  клетки двумя вирусами, у одного из которых геном поврежден, а  у другого - полноценный. При такой  смешанной инфекции возникает рекомбинация, в результате которой появляются вирионы со свойствами обоих родителей.

Гетерозиготность - это формирование вирусов, содержащих в своем составе  два разных генома или один полный геном одного вируса и часть генома другого вируса. Гетерозиготность имеет  место при совместном культивировании  двух штаммов вируса.

Комплементация - это такое  взаимодействие вирусов, когда один их них, или оба, предоставляют друг другу недостающие белки для  размножения и развития. Комплементация может активизировать изначально не жизнеспособные вирусы. Примером может  служить покрытие дельта-вируса белком вируса генотипа В-Hbs- антигеном.

Фенотипическое смешивание - это процесс при котором геном  одного из вирусов оказывается заключенным  в капсид другого. Фенотипическое смешивание наблюдают при совместном культивировании  вирусов.