Методи цитологічного та цитохімічного дослідження

Розрахунок електронної  щільності всередині елементарної комірки і визначення координат  атомів, які ототожнюються з положенням максимумів електронної щільності. Ці дані отримують аналізом інтенсивності дифракційних максимумів.

Для встановлення атомної  структури середньої складності (~ 50 - 100 атомів в елементарній комірці) необхідно вимірювати інтенсивності  кількох сотень і навіть тисяч  дифракційних відбиттів. Цю досить трудомістку і копітку роботу виконують автоматичні мікрофотометри і дифрактометри, керовані ЕОМ, іноді протягом декількох тижнів і навіть місяців (наприклад, при аналізі структур білків, коли число віддзеркалень зростає до сотень тисяч). У зв'язку з цим в останні роки для вирішення завдань рентгеноструктурного аналізу отримали широке застосування швидкодіючі ЕОМ. Однак навіть із застосуванням ЕОМ визначення структури залишається складною і трудомісткою роботою. Застосування в дифрактометрі декількох лічильників, які можуть паралельно реєструвати відображення, час експерименту вдається скоротити. Дифрактометричні вимірювання перевершують фотореєстрації по чутливості і точності. Дозволяючи об'єктивно визначити структуру молекул і загальний характер взаємодії молекул в кристалі, дослідження методом рентгеноструктурного аналізу не завжди дає можливість з потрібним ступенем достовірності судити про відмінності в характері хімічних зв'язків усередині молекули, так як точність визначення довжин зв'язків і валентних кутів часто виявляється недостатньою для цієї мети . Серйозним обмеженням методу є також труднощі визначення положень легких атомів і особливо атомів водню.

6.3Хроматографія.

Хроматографія - метод розділення й аналізу сумішей речовин, а  також вивчення фізико-хімічних властивостей речовин. Заснований на розподілі речовин між двома фазами - нерухомої (тверда фаза або рідина, пов'язана на інертному носії) і рухомого (газова або рідка фаза, елюєнт). Назва методу пов'язане з першими експериментами по хроматографії, в ході яких розробник методу Михайло Колір поділяв яскраво забарвлені рослинні пігменти.

Класифікація видів хроматографії

За агрегатним станом фаз:

• Газова хроматографія;
• Рідинна хроматографія;
• Надкритична флюїдна хроматографія;

За механізмом взаємодії:

• Розподільна хроматографія;
• Іонообмінна хроматографія;
• Адсорбційна хроматографія;
• Ексклюзійна хроматографія;
• гель-хроматографія;
• Осадова хроматографія;

Газова хроматографія 

Газова хроматографія — це метод розділення, в якому рухомою фазою є газ (газ-носій), а нерухомою — тверда речовина або рідина, яка нанесена на твердий інертний носій або рівномірно покриває внутрішні стінки колонки (нерухома фаза поміщена у колонку). Газова хроматографія заснована на механізмах адсорбції або розподілу. Обладнання складається з системи подавання газу, пристрою для введення проби, хроматографічної колонки, детектора і реєструючого пристрою. Колонки зазвичай виготовляють зі скла або нержавіючої сталі й заповнюють нерухомою фазою. Газ-носій проходить із заданою швидкістю через пристрій уведення проби, колонку, а потім — через детектор. Визначення проводять при сталій температурі або відповідно до заданої температурної програми. Детектори газової хроматографія (полуменево-іонізаційний, за теплопровідністю, термоіонний, мас-спектрометричний, за захопленням електронів тощо) найбільш універсальні й чутливі серед інших хроматографічних методів. Колонку, пристрій уведення проби і детектор термостатують при зазначеній температурі. Готують розчин, який випробовують, і розчин  порівняння, як зазначено в окремій статті. Використовуючи розчини порівняння, налагоджують прилад і добирають об’єми проб, що вводяться і дозволяють одержати необхідний сигнал. Виконують повторні введення для перевірки збігу сигналу і перевіряють, якщо необхідно, кількість теоретичних тарілок. Уводять розчини і реєструють результати хроматографування. Визначають висоту (при ізотермічному визначенні, якщо коефіцієнт симетрії становить 0,8–1,2) або площу піків аналізованих компонентів. Для розрахунків вмісту аналізованого компонента використовують методи зовнішнього або внутрішнього стандарту. Для розрахунку вмісту домішок може використовуватися, де це можливо, метод внутрішньої нормалізації. У цих випадках рекомендують застосовувати широкодіапазонний підсилювач та автоматичний інтегратор.

Рідинна хроматографія.

 Рідинна хроматографія — це метод розділення, в якому рухомою фазою є рідина, а нерухомою фазою, поміщеною в колонку, — тонкодисперсна тверда речовина або рідина, нанесена на твердий тонкодисперсний носій, у т.ч. хімічно модифікований шляхом уведення органічних груп. Рідинна хроматографія заснована на механізмах адсорбції, розподілу, іонного обміну або розподілу за розмірами молекул. Залежно від природи рухомої фази в адсорбційній рідинній хроматографії розрізняють нормально-фазову та оборотно-фазову хроматографія У нормально-фазовій хроматографія. нерухома фаза — полярна (найчастіше силікагель), а рухома фаза — неполярна (гексан або суміш гексану з більш полярними органічними розчинниками — хлороформом, алкоголями тощо). Затримка речовин зростає зі збільшенням їх полярності. У нормально-фазовій хроматографії елюювальна здатність рухомої фази збільшується зі зростанням її полярності. У зворотно-фазовій хроматографії нерухома фаза — неполярна (гідрофобні силікагелі з привитими групами С8, С18); рухома фаза — полярна (суміш води і полярних розчинників; ацетонітрилу, метанолу, тетрагідрофурану тощо). Затримка речовин збільшується з підвищенням їх гідрофобності (неполярності). Найменшу елюювальну здатність має вода, а для підвищення елюювальної здатності в рухому фазу вводять ацетонітрил, метанол та інші розчинники. Обладнання зазвичай складається із системи подавання рухомої фази, пристрою введення проби (з використанням шприца або петльового дозатора), хроматографічної колонки, детектора і реєструючого пристрою. Рухома фаза зазвичай подається під тиском з однієї або кількох посудин і протікає через пристрій уведення проби, колонку, а потім — через детектор із заданою швидкістю. Температуру хроматографічної колонки підтримують сталою. Склад рухомої фази залежно від зазначеного в окремій статті може або залишатися сталим протягом усього аналізу (ізократичне елюювання), або змінюватися відповідно до заданої програми (градієнтне елюювання).

Ексклюзивна хроматографія — окремий вид рідинної колонкової хроматографії., хроматографічний метод, в якому процес розподілу молекул речовин у розчині відбувається відповідно до їх розмірів. При використанні органічної рухомої фази метод називають гель проникаючою хроматографією, а при використанні водної рухомої фази — гель-фільтраційною хроматографією. Проба вводиться в колонку, заповнену гелем або пористими частками наповнювача, і переноситься рухомою фазою через колонку. Розподіл за розмірами відбувається за рахунок багаторазового обміну молекул розчиненої речовини між розчинником рухомої фази і цим самим розчинником (нерухома фаза) у порах матеріалу, яким заповнена колонка. Діапазон розмірів молекул, що розділяють, визначається діапазоном розмірів пор наповнювача. Досить маленькі молекули, здатні проникати в усі пори матеріалу стовпчика, елююються в повному об’ємі колонки (V_t — повний проникаючий об’єм або межа ексклюзії). Молекули речовини, що перевищують за розміром усі пори матеріалу колонки, не стримувані ним, мігрують лише через простір між частками наповнювача і елююються у вільному об’ємі колонки (V₀ — об’єм ексклюзії, або мертвий об’єм). Розподіл молекул речовин за розмірами відбувається між вільним об’ємом і повним об’ємом колонки; найбільш ефективний розподіл відбувається в перших двох третинах цього діапазону. Специфічною частиною обладнання є хроматографічна колонка відповідних розмірів, заповнена матеріалом, що забезпечує розподіл молекул за розмірами у потрібному діапазоні. Якщо необхідно, колонку термостатують. Через колонку з постійною швидкістю пропускають елюент. До одного кінця колонки приєднують пристрій уведення проби, напр. інжектор з припиненням потоку, шприцевий інжектор з мембраною для введення проби без припинення потоку або петльовий інжектор з клапаном, що перемикає потік. До цього кінця колонки також може бути приєднаний відповідний насос для подавання елюенту з контрольованою швидкістю. Проба може також наноситися безпосередньо на суху поверхню матеріалу колонки або, якщо густина проби перевищує густину елюенту, нашаровуватися на поверхню матеріалу колонки під елюент. Інший кінець колонки приєднують до відповідного детектора з пристроєм, що реєструє й забезпечує контроль відносних концентрацій розподілюваних компонентів проби. Як наповнювач може використовуватися або м’який матеріал (набухлий гель), або жорсткий (пористе скло, силікагель), або поперечнозшитий органічний полімер, який підходить для цього розчинника. При використанні жорстких матеріалів застосовують подавання рухомої фази під тиском, що прискорює розподіл. Рухому фазу вибирають з урахуванням природи проби, наповнювача і методу детектування. Зазвичай використовують такі детектори: фотометричний, рефрактометричний або люмінесцентний. Якщо необхідно, може бути приєднаний автоматичний колектор фракцій. Основне застосування у фармацевтичному аналізі — аналіз полімерів (напр. декстранів).

Флюїдна хроматографія

Флюїдна (надкритична) хроматографія — метод хроматографічного розділення, в якому рухома фаза є флюїдом (газом у надкритичному або субкритичному стані). Нерухома фаза, поміщена в колонку, є добре поділеними твердими частками (силікагель або пористий графіт), хімічно модифікованою нерухомою фазою (використовують у рідинній хроматографія) або поперечно зв’язаною рідкою плівкою, рівномірно нанесеною на стінки колонки для капілярних колонок. Флюїдна хроматографія ґрунтується на механізмах адсорбції або масового розподілу. Обладнання складається з насосної системи, що охолоджується, інжектора, хроматографічної колонки, поміщеної в термостат, детектора, регулятора тиску і приладу для оброблення даних (інтегратор або самописець). Рухому фазу становить оксид вуглецю, який може містити полярні модифікатори (метанол, 2-пропанол і ацетонітрил). Склад, тиск (густина), температура та швидкість її потоку можуть бути постійними або змінюватися згідно із заданою програмою. Звичайно використовують спектрофотометричний або полуменево-іонізаційний детектори. Можуть також використовувати інші спеціальні детектори. Флюїдна хроматографія поєднує в собі переваги рідинної хроматографія (висока розчинювальна здатність) і газової хроматографія (висока ефективність та універсальне детектування). Її застосовують для важколетких і термолабільних сполук, особливо природного походження.

         6.4Диференціальне центрифугування.

Для того щоб вивчити склад  і функції тих чи інших клітин, застосовують метод диференціального центрифугування. Цей метод заснований на відмінності в швидкостях седиментації частинок, що відрізняються один від одного розмірами і щільністю. Розділяючий матеріал, наприклад гомогенат тканини, центрифугують при ступінчастому збільшенні відцентрового прискорення, яке вибирається так, щоб на кожному етапі на дно пробірки осаджувалася певна фракція. В кінці кожної стадії осад відокремлюють від над осадової рідини і кілька разів промивають, щоб у кінці отримати чисту осадову фракцію. На жаль, отримати абсолютно чистий осад практично неможливо; щоб зрозуміти, чому це відбувається, звернемося до розгляду процесу, що відбувається в центрифужній пробірці на початку кожної стадії центрифугування.

Спочатку всі частинки гомогенату розподілені за обсягом  центрифужній пробірки рівномірно, тому отримати чисті препарати осадів самих важких частинок за один цикл центрифугування неможливо: перший утворився осад містить в основному  найважчі частинки, але, крім цього, також  деяку кількість всіх вихідних компонентів. Одержати досить чистий препарат важких частинок можна лише при повторному суспензуванні і центрифугуванні вихідного осаду. Подальше центрифугування супернатанту при подальшому збільшенні відцентрового прискорення призводить до седиментації частинок середніх розмірів і щільності, а потім і до осадження найдрібніших частинок, що мають найменшу щільність. 

Диференціальне центрифугування  є, мабуть, найпоширенішим методом виділення  клітинних органел з гомогенатів  тканин. Найбільш успішно застосовується цей метод для розділення таких клітинних органел, які значно відрізняються один від одного за розмірами і щільності. Але навіть і в цьому випадку одержувані фракції ніколи не бувають абсолютно гомогенними, і для їх подальшого поділу застосовують інші методи.

Висновки

           Для вивчення клітини використовуються цитологічні та цитохімічні методи. Цитологічні дослідження – це дослідження і вивчення клітини під мікроскопом. Мікроскопію поділяють на світлову та електронну. При світловій мікроскопії досліджують препарати, крізь які можуть проходить світло. Є дуже багато різних методів дослідження клітини під світловим мікроскопом. Найвідоміші з них є метод світлого і темного поля, метод ультрамікроскопії, метод фазового й інтерференційного контрасту. Також виділяють поляризаційну і люмінесцентну мікроскопію. В електронному мікроскопі замість світлового випромінення використовується пучок електронів. За допомогою електронного мікроскопа вивчають неживі об’єкти. До електронної мікроскопії відносять трансмісійну і  растрову мікроскопію. У сучасних цитологічних дослідженнях застосовують багато інших методів, а саме цитохімічні методи. За допомогою цитохiмiчних реакцiй можна виявити багато неорганiчних речовин, сполуки калію, натрію, феруму, кальцію, купруму, фосфору, гiдрогену, сульфуру, нірогену та iнших, а також органiчнi речовини - білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, лiпiди тощо. Найвідоміші з цих методів є метод мічених атомів, рентгеноструктурный аналіз, хронографія, диференціальне центрифугування. Всі методи допомогли зробити великий крок у дослідженні клітин.

Список використаної літератури

1. Трускавецький Є.С., Цитологія: Підручник. – К.: Вища шк., 2004 – 254с.: іл.
2. Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине: Справочник.— Барнаул: Азбука, 2003. — 40 с.
3. Михель К., Основы теории микроскопа, пер. с нем., M., 1955; Франсон M., Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., M., 1960; Чуриловский В. H., Теория оптических приборов, M.- Л., 1966; Микроскопы, под ред. H. И. Полякова, Л., 1969; Fедин Л. А., Барский И. Я., Микрофотография, Л., 1971; Агроскин Л. С., Папаян Г. В., Цитофотометрия, Л., 1977. Г. В. Папаян.
4. Шиммель Г., Методика электронной микроскопии, пер. с нем., М., 1972; Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ, пер. с англ., т. 1-2, М., 1984.
5. Українська радянська енциклопедія / За ред. М. Бажана. — 2-ге вид. — К., 1974—1985.
6. Дьяченко П. Е. Применение радиоактивных изотопов. М., 1958;
7. Жданов Г.С. Физика твёрдого тела, М., 1962.