Методи цитологічного та цитохімічного дослідження

Міністерство науки і  освіти України

НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ  УНІВЕРСИТЕТ

«Київський політехнічний  інститут»

Факультет біотехнології  та біотехніки

Кафедра промислової біотехнології

 

 

 

Реферат з предмету: «Біологія  клітини»

Тема: «Методи цитологічного  та цитохімічного дослідження»

 

 

 

Роботу виконала

Студентка 1 курсу

Факультету ФБТ, гр. БТ-01

Богун Тетяна Андріївна

 

 

Роботу перевірила

Доцент Жолнер Л.Г.

 

 

 

 

 

 

 

Київ 2010

Зміст.

Вступ……………………………………………………………………………..3

1. Фіксатори для цитологічних робіт…………………………………………4
2. Барвники……………………………………………………………………...6
3. Мiкроскопiчне дослiдження………………………………………………..11
4. Оптична мікроскопія………………………………………………………..11
1. Метод світлого поля…………………………………………………….12
2. Метод темного поля…………………………………………………….12
3. Метод ультрамікроскопія………………………………………………15
4. Метод фазового контрасту……………………………………………..15
5. Метод інтерференційного контрасту………………………………….17
6. Поляризаційна мікроскопія……………………………………………18
7. Люмінесцентна мікроскопія…………………………………………….19
8. Метод спостереження в ультрафіолетових та інфрачервоних променях…………………………………………………………………20
5. Електронна мікроскопія…………………………………………………….21
1. Трансмісійна мікроскопія………………………………………………21
2. Растрова мікроскопія……………………………………………………23
6. Цитохімічні дослідження…………………………………………………….26
1. Метод мічених атомів…………………………………………………..26
2. Рентгеноструктурный аналіз…………………………………………..29
3. Хроматографія………………………………………………………….30
4. Диференціальне центрифугування…………………………………….35

Висновки………………………………………………………………………..37

Список використаної літератури……………………………………………..38

 

 

 

 

 

 

 

Вступ

Клітина - елементарна одиниця  будови і життєдіяльності всіх живих  організмів, що володіє власним обміном  речовин, здатна до самостійного існування, самовідтворення і розвитку. Всі живі організми або, як багатоклітинні тварини, рослини і гриби, складаються з багатьох клітин, або, як багато найпростіші і бактерії, є одноклітинними організмами. Розділ біології, що займається вивченням будови і життєдіяльності клітин, отримав назву цитології.

Усі клітини можна поділити на два види  - прокаріоти (доядерние) і еукаріоти (ядерні). Прокаріотичні  клітини - простіші за будовою, мабуть, вони виникли в процесі еволюції раніше. Еукаріотичні клітини - більш складні, виникли пізніше. Незважаючи на різноманіття форм організація клітин усіх живих організмів підпорядкована єдиним структурним принципам.

Клітини  відокремлені від навколишнього середовища плазматичною  мембраною. Усередині клітина заповнена цитоплазмою, в якій розташовані різні органели та клітинні включення, а також генетичний матеріал у вигляді молекули ДНК. Кожна з органанел клітини виконує свою особливу функцію, а в сукупності всі вони визначають життєдіяльність клітини в цілому.

Розміри клітини дуже малі, тому для вивчення клітин використовують різні оптичні прилади.

Для того щоб почати розглядати і досліджувати клітини під мікроскоп  їх спочатку треба підготувати, застосовуючи фіксацію, зневоднення, виготовлення тонких зрізів, фарбування. Звичайно в цитології використовують й інші методи дослідження клітини. Важливе місце посідають цитохімічні дослідження. Суть цих методів полягає в тому, що вони дають змогу визначати певні хімічні компоненти та їх локалізацію в клітині.

 

 

1.Фіксатори для цитологічних робіт

Фіксацією рослинних тканин називають процес швидкої інактивації  ферментів у спеціально підібраних розчинах отруйних речовин. Фіксатор повинен вбивати клітину, не спотворюючи при цьому її структури, проте фіксація пов'язана з незворотними змінами в тому чи іншому хімічному компоненті клітини. Існує велика різноманітність фіксаторів, призначених для різних об'єктів і фіксації ядра і пластид клітин, цитоплазми і т.п. Фіксація передує фарбуванню препарату, у зв'язку з чим розчин повинен містити речовини, які відіграють роль протрави.

Часто для фіксації клітин використовуються альдегіди і їх суміші з іншими речовинами. Як фіксатори  застосовують також спирти, що викликають необоротну денатурацію білків, осадження  нуклеїнових кислот і полісахаридів. Облягаючою дією володіють також  сулемові фіксатори і фіксатори  з покриновою кислотою. Фіксатори, що містять чотириокис осмію, добре  зберігають ліпіди.

Формалiн.

 Формалiн - це 40 %-й водний  розчин формальдегіду (газоподібної  речовини).

Для фіксації його використовують або в складi складних фiксуючих  сумiшей, або користуються 10 %-м розчином «продажного» формаліну. Формалін має  рiзкий запах, нерiдко зумовлює сльозотечу, подразнює слизовi оболонки дихальних  шляхiв. Формалін швидко проникає в  об'єкт. Тривалiсть фіксації становить від 1 год. до кількох дiб i навіть місяців. Пiсля фіксації формаліном потрiбно ретельно вiдмити шматочок тканини проточною водою. Тривалiсть промивання має 6ути близькою до тривалості фіксації, однак промивання бiльше доби (навіть у разi тривалої фіксації) не рекомендується. Формалгін застосовують для фіксації клiтин пiд час вивчення їхньої загалъної морфології, а також для збереження та наступного виявлення в клiтинах жирiв i лiпiдiв. При цьому слiд мати на увазi, що в разi тривалого зберiгання об’єктів у формалiнi може вiдбутися руйнування частини лiпiдiв пiд дією лiпаз, активнiсть яких у нъому зникає не повнiстю. Пiсля фіксації формаліном у клiтинах зберігається глiкоген, що також можна виявити наступною гiстохiмiчною реакцією.

Вважають, що формалін сполучається з амінокислотами, нейтралiзуючи  їхні основні групи. У зв'язку з  цим бiлки починають виявляти 6iльшу спорiдненiсть до основних 6арвникiв, нiж пiд час iнших фiксацiй, i починають  гiрше фарбуватися кислими барвниками.

Дуже часто формалiн використовуєгься як один iз компонентів у складних фiксуючих сумiшах. До них належать фiксатор ФСУ (формалін-спирт-оцтова кислота), кальційформол (за Беккером), фiксатор Шабадаша та ін.

Сулема.

Сулема зазвичай не використовується для фiксацiї в чистому виглядi, але широко застосовуєтъся у складi складних фiксуючих сумішей. Вона швидко проникає в тканини, мало стискає об'єкт, але досить грубо осаджує 6iлки 
Для видалення сулеми з тканин для наступного фар6ування об'єкта потрi6не промивання шмагочків тканини проточною водою i занурення об'екта в 70 %-й спирт iз добавлянням у середовище йоду та йодиду калiю .

Етанол.

Етиловий спирт, так само як i сулему, рiдко аастосовують для фiксацiї в чистому виглядi, оскiльки він дуже зморщує й ущільнює тканини, денатурує 6iлки. Етанол також осаджує глiкоген, а жири розчиняє. Спирт швидко проникає в тканини, вiднiмаючи воду.

Найпоширеніший спиртовмiсний фiксатор - сумiш Карнуа.

Чотириоксид осмiю.

Чотириоксид осмiю (його часто називають осмієвою кислотою)  застосовують як фiксатор у виглядi 1-2 %-го розчину , приготовленого на бiдистильованiй водi чи фосфатоному 6уферi при рН = 7,2 - 7,4. Iнодi фiксують у парi осмієвої кислоти. Для роз6авляння фіксатора потрi6но особливо ретельно вимити посуд. Фіксатор з6ерiгають у темрявi в холодильнику, в щiльно закритому 6утлi. Пара чотириоксиду осмiю подразнює слизовi оболонки, тому рекомендується готувати й переливати фіксатор пiд тягою. Осмієва кислота - один iз найкращих фiксаторiв для загальноцитологiчного дослiдження клiтин i тканин, оскільки він добре зберігає тонку структуру клiтини. Це один iз основних фiксаторiв i для електронної мікроскопії. Якщо осмієва кислота потемнiла або в нiй випав осад, використовувати її для фіксації вже не можна. Слiд мати на увазi, що чотириоксид осмiю повiльно проникає в тканини, тому шматочки тканин перед зануренням їх у фiксатор мають 6ути дрi6но нарiзанi. Діаметр їх не повинен перевищувати 2 мм для світлової мікроскопії i 0,5-1 мм для електронної.

2.Барвники

         Майже всі клітини прозорі, тому клітини фарбують. Барвники потрапляють в клітину, сполучаються з певними компонентами цитоплазми і забарвлюють їх. Це дає змогу виявити і дослідити багато клітинних структур.

Барвниками називають  органічні з’єднання, що мають здатність поглинати і перетворювати світлову енергію у видимих ближніх ультрафіолетовому і інфрачервоному спектрах. Поглинаючи частину світлових променів певної довжини хвилі, ці з'єднання стають кольоровими. Застосування речовин, здатних надавати той чи інший колір предметам, в тому числі волокнам, тканинам, поверхні тіла, відоме ще з давніх давен. Для цього використовували кольорові глини, мінеральні пігменти, витяжки з рослин і тварин. На сьогодні відомо більше ніж 3500, але не всі з них використовуються в мікроскопії. Для кожного біологічного об'єкта, в залежності від цілей дослідження, обирають свій барвник і свій метод фарбування. Число таких методів набагато перевершує число барвників. 

Барвники, що використовуються в біології, можна класифікувати за такими критеріями:

• За джерелом отримання.
• За хімічним складом.
• Щодо використання або здатності барбувати певні 
  структури.

Класифікація за джерелами  отримання дуже проста, але практичного  значення не має. Наприклад, такі барвники, як індиго чи орсеїном в наш час можуть бути отримані як з природних джерел, так і синтетично. У принципі, розрізняють 3 джерела отримання барвників: хімічний синтез, витяжки з рослин та екстракти тваринного походження. 
1.1. Хімічна класифікація

Перша хімічна класифікація барвників була заснована на хромофорно-ауксохромній теорії кольоровості, яка пояснювала забарвлення органічних сполук присутністю  в їх молекулах типових хромофорних  груп.За цією ознакою в самостійні класи були виділені нітрокрасителі, нітрозокрасітелі, азобарвники та ін.

1.Нітро- і нітрозобарвники.

2. Поліметинові барвники.

3. Арілметанові барвники.

4. Хінонімінові барвники.

5. Азобарвники.

6. Азометинові барвники.

7. Антрахінові барвники.

8. Кубові барвники:

8.1. індигоїдний і тіоіндігоїдний;

8.2. антрахінонові

8.3. перінонов.

8.4. поліціклохінові.

9. Антрапірідинові барвники.

10. Сірчисті барвники.

11. Фталоціанові барвники.

12. Флуоресцентні (оптичні) відбілювачі.

1.2. Робоча класифікація барвників, використовуваних у біологічній мікроскопії 
Існує чимало робочих класифікацій барвників, що використовуються в біології. При викладі матеріалу автори рідко дотримуються чіткого поділу. Зазвичай розрізняють чотири великі групи барвників: 

• Основні (або ядерні) барвники. Вони вибірково забарвлюють ядра клітин і базофільні структури. 
• Кислі (або цитоплазматичні) барвники. Фарбують переважно цитоплазму, рідше клітинні стінки.
• Нейтральні барвники. До цієї групи повинні бути віднесені й такі барвники, які вибірково забарвлюють компоненти цитоплазми, наприклад, судан III фарбують крапельки жиру.
• Флюорохромні. Група барвників, здатних до флюоресцентності при тій чи іншій довжині хвилі збуджуючого світла. 

1.2.1. Ядерні барвники

Ядерні барвники представляють  собою чи не найчисленнішу групу  барвників. Основна мета обробки даними речовинами полягає в тому, щоб виявити матеріал, близький до ДНК або РНК. По механізму фарбування ядерні барвники ділять на дві групи. Це основні барвники та протравні барвники. 
1.2.1.1. Основні барвники

Застосування основних барвників (всі вони є «катіонними») полягає  в утворення  з'єднань типу солей  у присутності ДНК або РНК.

• Азобарвники:
• Янус зелений В;
• Бісмарк коричневий.
• Сафраніном:
• Сафраніном Т;
• Сафраніном А;
• Сафраніном О;
• Феносафранін.
• Оксазінові барвники:
• Діамантовий крезіловий синій;
• Крезіловий міцний фіолетовий.
• Тіазини:
• Тіоніном;
• Азур з, А, В;
• Метиленовий синій;
• Толуїдиновим синій.
• Трифенілметановий:
• Пара- Розанілін;
• Кристалічний фіолетовий;
• Метиловий фіолетовий;
• Метиловий зелений;
• Альціановий синій;