Методи цитологічного та цитохімічного дослідження

4.8Метод спостереження в ультрафіолетових та інфрачервоних променях.

Метод спостереження в  ультрафіолетових (УФ) променях робить можливим збільшення граничної роздільної здатності мікроскопа. Головна перевага методу полягає в тому, що частинки багатьох речовин, прозорі у видимому світлі, сильно поглинають УФ випромінювання певних довжин хвиль і, отже, легко  помітні в УФ зображеннях. Характерними спектрами поглинання в УФ області  мають багато речовин, що містяться  в рослинних і тваринних клітинах (пуринові основи, піримідинові підстави, більшість вітамінів, ароматичні амінокислоти, деякі ліпіди, тироксин та ін.)

Так як ультрафіолетові промені  невидимі для людського ока, то зображення в УФ мікроскопії реєструють або  фотографічно, або за допомогою електронно-оптичного  перетворювача або люмінесцентного  екрану. Препарат фотографується в  трьох довжинах хвиль УФ області  спектру. Кожен з отриманих негативів  висвітлюється видимим світлом  певного кольору (наприклад, синім, зеленим і червоним), і всі вони одночасно проектуються на один екран. Результат - кольорове зображення об'єкта в умовних кольорах, що залежать від поглинання препарату в ультрафіолеті.

Метод спостереження в  інфрачервоних (ІЧ) променях також вимагає  перетворення невидимого для ока  зображення у видиме з використанням  фотографування або за допомогою  електронно-оптичного перетворювача. ІК мікроскопія дає можливість вивчати внутрішню структуру тих об'єктів, які непрозорі в видимому світлі, наприклад деяких кристалів і мінералів.

5. Електронна мікроскопія

Електронна мікроскопія, сукупність електронно-зондових методів  дослідження мікроструктури твердих  тіл, їх локального складу і мікрополів (електричних, магнітних та ін) за допомогою  електронних мікроскопів (ЕМ) - приладів, в яких для отримання збільшення зображень використовують електронний пучок. Електронна мікроскопія включає також методики підготовки об'єктів, що вивчаються, обробки та аналізу результуючої інформації. Розрізняють два головні напрямки електронної мікроскопії: трансмісійну (просвічує) і растрову (скануючу), заснованих на використанні відповідних типів ЕМ. Вони дають інформацію про об'єкт дослідження і часто застосовуються спільно. Відомі також відбивна, емісійна,  лоренцова та інші види електронної мікроскопії, що реалізуються, як правило, за допомогою приставок до трансмісійним і растрових ЕМ.

5.1Трансмісійна мікроскопія

Трансмісійна мікроскопія  реалізується за допомогою трансмісійних (просвічують) електронних мікроскопів (ТЕМ; рис. 3), в яких тонко плівковий об'єкт просвічується пучком прискорених електронів з енергією 50-200 кеВ. Електрони, відхилені атомами об'єкта на малі кути і пройшли крізь нього з невеликими енергетичними втратами, потрапляють у систему магнітних лінз, які формують на люмінесцентному екрані (і на фотоплівці) світлопольове зображення внутрішньої структури. При цьому вдається досягти роздільну здатність порядку 0,1 нм, що відповідає збільшенням до 1,5 х 106 разів. Розсіяні електрони затримуються діафрагмами, від діаметра до яких в значить, ступені залежить контраст зображення. При вивченні сильнорозсіюючих об'єктів більш інформативні темнопольові зображення. 
Роздільна здатність та інформативність ТЕМ-зображень багато в чому визначаються характеристиками об'єкта та у спосіб його підготовки. При дослідженні тонких плівок і зрізів полімерних матеріалів і біол. тканин контраст зростає пропорційно їх товщині, але одночасно знижується роздільна здатність. Тому застосовують дуже тонкі (не більше 0,01 мкм) плівки і зрізи, підвищуючи їх контраст обробкою сполуками важких металів (Os, U, Pb і ін), які вибірково взаємодіють з компонентами мікроструктури (хімічне контрастування). Для вивчення форми і розмірів мікрочастинок (мікрокристали, аерозолі, віруси, макромолекули) їх наносять у вигляді суспензій або аерозолів на плівки-підкладки з полівінілформаля або аморфного С, проникні для електронного променя, і контрастують методом відтінення або негативного контрастування.

 
  
Рис. 3. Схема пристрою трансмісійного електронного мікроскопа: 1 - електронна гармата, 2 - конденсор; 3-зразок; 4, 5 - об'єктив і його діафрагма; 6, 7 - проміжна і проекційна лінзи; 8-оглядове вікно; 9 - люмінесцентний екран; 10 - фотокамера з затвором; 11 - вакуумна система.

Структура гелів, суспензій, емульсій і біол. тканин з великим вмістом води може бути досліджена методами кріореплікаціі: зразки піддають надшвидкому заморожування і поміщають у вакуумну установку, де виробляється розколювання об'єкта і осадження на поверхню свіжого відколу плівки аморфного С і відтіняючого металу. Отримана репліка, що повторює мікрорельєф поверхні відколу, аналізується в ТЕМ. Розроблено також методи, що дозволяють робити ультратонкі зрізи заморожених об'єктів і переносити їх, не розморожуючи, в ТЕМ на кріостолик, зберігаючи стан об'єкта в ході спостереження на рівні -150 ° С (кріоультратомія і кріомікроскопія).

5.2Растрова мікроскопія

Растрова (скануюча) мікроскопія. У растрових електронних мікроскопах (РЕМ; рис. 4) електронний промінь, стислий магнітними лінзами в тонкий (1-10 нм) зонд, сканує поверхню зразка, формуючи на ній растр з декількох тисяч паралельних ліній. Виниклі при електронному бомбардуванні поверхні, вторинні випромінювання реєструються різними детекторами і перетворюються в відеосигнали, моделюючи електронний промінь в ЕПТ. Розгортки променів у колоні РЕМ та в ЕПТ синхронні, тому на екрані ЕПТ з'являється зображення, що представляє собою картину розподілу інтенсивності одного з вторинних випромінювань по скануючій площі об'єкту. Збільшення РЕМ визначається як М = L / l, де L і l - довжини ліній сканування на екрані ЕПТ і на поверхні зразка.

 
  
Рис. 4. Схема пристрою растрового електронного мікроскопа: 1 - електронна гармата, 2 - конденсор, 3 – відхиляюча система; 4 - кінцева лінза з коректором астигматизму; 5 - об'єктний столик; 6 - зразок; 7 - вакуумна система; 8 - генератор розгорток; 9 - блок управління збільшенням; 10-селектор сигналів (для вибору реєстрованого вторинного випромінювання); 11-видеопідсилювач; 12,13 - ЕПТ і її відхиляюча система; BВ1-BВ3 - потоки вторинних випромінювань; C1 - C3 - електричні. сигнали; Д1-Д3 - детектори; ЕП1, ЕП2 - електронні промені; X, Y - напрямки сканування (рядкова і кадрова розгортки).

Вибір реєстрованого вторинного випромінювання обумовлений завданням  дослідження. Основний режим роботи РЕМ - реєстрація вторинних електронів (ВЕ). Оскільки інтенсивність емісії ВЕ сильно залежить від кута падіння електронного променя на поверхню, одержуване зображення дуже близьке до звичайного макроскопічного зображення рельєфу об'єкта, освітлений з усіх сторін розсіяним світлом; інакше кажучи, формується топографічний контраст. Емісія ВЕ відрізняється найбільше інтенсивністю в порівнянні з іншими вторинними випромінюваннями. Крім того, в цьому режимі досягається максимальна роздільна здатність.

Тонкоплівкові зразки (до 1 мкм) просвічуються електронним променем наскрізь і пройдені  електрони  реєструються детектором, розташованим під об'єктом. Зображення, отримані в цьому режимі, іноді більш інформативні, ніж звичайні ТЕМ-зображення, тому що вільні від хроматичної аберації. 
Для вивчення структури поверхні за допомогою РЕМ до зразка пред'являється ряд вимог. Перш за все, його поверхня повинна бути електропровідною, щоб виключити перешкоди за рахунок накопичення поверхневого заряду при скануванні. Крім того, потрібно всіляко підвищувати відношення сигнал / шум, яке поряд з параметрами оптичної системи визначає роздільна здатність. Тому перед дослідженням на діалектрічність поверхні шляхом вакуумного випаровування або іонного розпилення наносять тонку (15-20 нм) однорідну плівку металу з високим коефіцієнтом вторинної електронної емісії (Au, Au-Pd, Pt-Pd). Біологічні об'єкти, що містять, як правило, велику кількість води, перед нанесенням металу необхідно зафіксувати спеціальною хімічною обробкою і висушити, зберігши природний мікрорельєф поверхні.

Роздільна здатність РЕМ  визначається багатьма чинниками, які  залежать як від конструкції приладу, так і від природи досліджуваного об'єкта. Якщо зразок електро-і теплопровідний, однорідний за складом і не має поверхневої пористості, в РЕМ з вольфрамовими електродами досягається роздільна здатність 5-7 нм, в РЕМ з електронними гарматами на польовій емісії - 1,0-1,5 нм.

Розвиток комп'ютерної  техніки зумовив значний прогрес в області математичної обробки електронних зображень (комп'ютерна морфометрія). Розроблені апаратно-програмні комплекси дозволяють: запам'ятовувати зображення, коригувати їх контраст; розширювати діапазон яскравостей шляхом ведення умовних кольорів; усувати шуми; підкреслювати кордони мікроділянок, виділяти деталі мікроструктури в заданому діапазоні розмірів і оптичної щільності; проводити статистичну обробку зображень і будувати гістограми розподілу мікрочастинок за розмірами, формою і орієнтації; розраховувати локальні мікроконцентрації елементів по елементно-селективним зображенням і спектрам та ін Крім того, вбудовані в ТЕМ та РЕМ процесори дозволяють гнучко управляти мікроскопами, значно знижують електронно-променеві пошкодження зразків, підвищують достовірність та відтворюваність результатів аналізу мікроструктури, полегшують працю дослідників.

6.Цитохімічні дослідження

Важливе місце посідають  цитохімічні дослідження. Суть цих  методів полягає в тому, що вони дають змогу визначати певні  хімічні компоненти та їх локалізацію  в клітині. За допомогою цитохiмiчних реакцiй можна виявити багато неорганiчних речовин, сполуки калію, натрію, феруму, кальцію, купруму, фосфору, гiдрогену, сульфуру, нірогену та iнших, а також органiчнi речовини - білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, лiпiди тощо.

6.1 Метод мічених атомів

В основі методу мічених атомів лежить той факт, що хімічні властивості  радіоактивних і нерадіоактивних  ізотопів однакові. Це означає, що в  хімічних реакціях із вихідних речовин  у продукти переходитимуть однакові частини обох типів ізотопів. Але  це можна використовувати на практиці тільки в тому випадку, якщо радіоактивний  і стабільний ізотопи знаходяться  в стані ідеального однорідного  розподілу в хімічній системі, причому  протягом усіх досліджуваних процесів однорідність розподілу (ізотопний  склад) не змінюється. Тоді можна простежити, по-перше, як змінюється концентрація досліджуваної сполуки в ході реакції, а по-друге, на яких етапах протікання реакції з нею починають  відбуватися зміни. Якісне дослідження  міченого елемента або його сполуки  проводять, виявляючи радіоактивність, а кількісне — заміряючи величину радіоактивності.

З величезної кількості радіонуклідів, відомих на сьогодні, тільки деякі  з них можна використовувати  як індикатори. При цьому до уваги  беруться як фізичні й хімічні  властивості радіонукліда, так і  економічні характеристики (доступність, вартість).

Основні показники, що беруться до уваги  при виборі індикатора:

— період піврозпаду;

— вид і енергія випромінювання;

— доступність радіонукліда;

— хімічна й радіоактивна чистота;

— хімічна форма.

Період піврозпаду радіонукліда, який збираються використовувати як індикатор, не повинен бути занадто малим. Якщо тривалість експерименту перевищує  період піврозпаду в 10 і більше разів, то такий радіонуклід використовувати  в тривалому експерименті не можна. Непридатні для радіоіндикаторного методу й радіонукліди з тривалим періодом піврозпаду, тому що в більшості  випадків вони випускають випромінювання з низькою енергією Найбільш придатними є радіонукліди з періодом піврозпаду від декількох годин до декількох  місяців.

Мічені атоми велике значення мають  при вивченні діяльності живих організмів та обміну речовин у них. При проведенні таких досліджень в їжу додають невелику кількість радіоактивних речовин. Переміщаючи вздовж тіла лічильник, можна визначити, в які частини організму і з якою швидкістю потрапляє той чи інший хімічний елемент.

Мічені атоми широко застосовують для вивчення життя рослин. Наприклад, за допомогою міченого радіоактивного фосфору можна визначити, як фосфор потрапляє у рослину, як переміщається  в ній і в яких місцях зосереджується.

Властивість хімічних елементів  концентруватися в різних тканинах та частинах організму лежить в основі застосування мічених атомів у біології і особливо в медицині. Наприклад, поглинання йодущитовидною залозою встановлено за допомогою мічених атомів йоду. Мічені атоми заліза дозволяють визначити загальний об'єм крові в організмі. Для цього у вену тварини вводять певну кількість крові з радіоактивним залізом. Через деякий час у цієї тварини беруть таку саму кількість крові. Відношення інтенсивності випромінювань радіоактивним залізом у взятій і введеній крові дорівнює відношенню кількості введеної крові до її загальної кількості. Мічені атоми допомагають визначити розміщення злоякісних пухлин в організмі, що значно полегшує роботу хірургів.

6.2 Рентгеноструктурный аналіз

Рентгеноструктурний аналіз - це метод дослідження будови тіл, використовує явище дифракції рентгенівських променів, метод дослідження структури речовини з розподілу в просторі і інтенсивностям розсіяного на аналізованому об'єкті рентгенівського випромінювання. Дифракційна картина залежить від довжини хвилі використовуваних рентгенівських променів і будови об'єкта. Для дослідження атомної структури застосовують випромінювання з довжиною хвилі ~ 1Å.

Методами рентгеноструктурного аналізу вивчають метали, сплави, мінерали, неорганічні і органічні сполуки, полімери, аморфні матеріали, рідини і гази, молекули білків, нуклеїнових  кислот і т.д. 

У ході рентгеноструктурного аналізу досліджуваний зразок поміщають  на шляху рентгенівських променів і  реєструють дифракційну картину, яка  виникає в результаті взаємодії  променів з речовиною. На наступному етапі дослідження аналізують дифракційну картину і розрахунковим шляхом встановлюють взаємне розташування частинок у просторі, що викликало появу даної картини.

Рентгеноструктурний аналіз кристалічних речовин розпадається на два етапи. Визначення розмірів елементарної комірки кристала, числа часток (атомів, молекул) в елементарній комірці і симетрії розташування частинок (так званої просторової групи). Ці дані отримують шляхом аналізу геометрії розташування дифракційних максимумів.