Методи цитологічного та цитохімічного дослідження

1.2.1.2. Протравні барвники

В основу методик застосування протравних барвників лягла здатність  ряду сполук утворювати яскраво забарвлені лаки з іонами металів - Літію, заліза, хрому. У цю групу входять:

• Гематоксилін;
• Кармін (кармінова кислота);
• Алізарин- цианін;
• Алізарин;
• Бразилін;
• Галоцианін. 
  

1.2.2. Цитоплазматичні барвники

Ця група фарбників  представлена здебільшого сульфоновими і карбоновими кислотами, які  в тканинах міцно зв'язуються з  білками і в результаті забарвлюють  більшість неядерних структур:

• Еозин;
• Аурамін О;
• Еритрозин;
• Родамін В;
• Родамін 3G;
• Родамін 6G;
• Піронін G;
• Акріфлавін;
• Флюоресцеіна;
• Акридинового оранжевий;
• Конго червоний;
• Акридинового жовтий;
• Кріофосфін;
• Нейтральний червоний;
• Толуїдиновим синій.

Цитоплазматичні барвники у  поєднанні з фосфорно- вольфрамової кислотою, фосфорно- молібденової кислотою можуть забарвлювати специфічні структури клітин і тканин, наприклад, колаген. У більшості методик цитоплазматичні барвники використовуються для контрасту після фарбування ядерними барвниками.

1.2.3. Нейтральні барвники 
Група нейтральних барвників невелика. Важливе практичне значення мають барвники, що забарвлюють жири:

• Судан III;
• Судан IV;
• Судан чорний;
• Нільський синій.

1.2.4. Флюорохроми 
Флюорохроми стоять окремо, тому що ця група включає і кислі, і основні барвники.

Головною відмітною рисою  всіх цих сполук є здатність випромінювати світло певної довжини хвилі під впливом променів ультрафіолетового, фіолетового та синього спектра. Молекула барвника, поглинувши квант падаючого світла, випускає світлове випромінювання більшої довжини хвилі, ніж довжина хвилі падаючого світла. Так, наприклад, флюоресцеїн, поглинаючи світло з довжиною хвилі 420 - 490 нм, випромінює світло з довжиною хвилі 520- 540 нм. при цьому об'єкти, пофарбовані флюоресцеїном в люмінесцентному мікроскопі, світяться зеленим світлом.

3.Мiкроскопiчне дослiдження

Мiкроскопiчне дослiдження живих  клiтин i тканин широко використовують у цитології. Для цього готують  препарати. Дрiбнi одноклiтиннi органiзми  переносять на предметне скло i дослiджують їх. Живi клітини багатоклiтинних органiзмiв  дослiджувати складніше, оскільки їх потрiбно виокремити з тканин, не пошкодивши, i забезпечити вiдповiднi умови для пiдтримання життєдіяльності.

4.Оптична мікроскопія

Оптична мікроскопія – це сукупність методів спостереження та дослідження за допомогою оптичного мікроскопа. Структуру будь-якого об'єкта (препарату) можна розрізнити, якщо різні його частки по-різному поглинають і відображають світло або відрізняються одна від одної (або від середовища) показниками заломлення. Ці відмінності зумовлюють різницю амплітуд або фаз світлових хвиль, що пройшли через різні ділянки препарату, від чого, у свою чергу, залежить контрастність зображення. У залежності від властивостей досліджуваного об'єкта і завдань дослідження існують різні. методи спостереження, що дають дещо відмінні зображення об'єкта (рис. 1).

4.1 Метод світлого поля в прохідному світлі найбільш, поширений. Він використовується для дослідження прозорих об'єктів з включеними в них абсорбуючими частинками і деталями.( наприклад, тонкі забарвлені зрізи тваринних і рослинних тканин, тонкі шліфи мінералів і т. д.) Пучок світла, проходячи через непоглинаючих зони препарату, дає рівномірно освітлене поле. Абсорбуюча частка на шляху пучка світла частково поглинає його, частково розсіює, внаслідок чого амплітуда пройшов через частку світла буде менше і частка виглядає на світлому тлі темною плямою (рис. 1, а). Контраст зображення мікроструктури об'єкта тим більше, чим більшим поглинанням у видимій області спектру має абсорбуюча частинка. Біологічні об'єкти, в більшості своїй не володіють цією властивістю, попередньо фарбуються спеціальними барвниками.

Метод косого освітлення - різновид попереднього методу. Відмінність між  ними полягає в тому, що світло на об'єкт направляють під великим  кутом до напрямку спостереження. Іноді  це допомагає виявити «рельєфність»  об'єкта за рахунок утворення тіней.

4.2Метод темного поля в прохідному світлі використовується для отримання зображень прозорих неабсорбуючих об'єктів, які не можуть бути видні, якщо застосувати метод світлого поля. Найчастіше це біологічні об'єкти. Світло від освітлювача і дзеркала направляється на препарат конденсором спеціальної конструкції - т. зв. конденсором темного поля. По виході з конденсора основна частина променів світла, не змінила свого напрямку при проходженні через прозорий препарат, утворює пучок у вигляді порожнього конуса і не потрапляє в об'єктив (який знаходиться всередині цього конуса). Зображення в мікроскопі формується за допомогою лише невеликої частини променів, розсіяних мікрочастинками знаходиться на предметному склі препарату всередину конуса і пройшли через об'єктив. Мікроскопія темного поля заснована на ефекті Тіндаля (Tyndall effect), відомим прикладом якого є виявлення порошин у повітрі при висвітленні їх вузьким променем сонячного світла. У полі зору на темному тлі видно світлі зображення елементів структури препарату, що відрізняються від навколишнього середовища показником заломлення. У великих часток видно тільки світлі краю, що розсіюють промені світла. Використовуючи цей метод, не можна визначити по виду зображення, прозорі частки або непрозорі, більший чи менший показник заломлення вони мають у порівнянні з навколишнім середовищем.

Для проведення досліджень методом темного поля предметні скла повинні бути не товще 1,1-1,2 мм, покривні 0,17 мм, без подряпин і забруднень. При приготуванні препарату слід уникати наявності пухирців і великих частинок (ці дефекти будуть яскраво світитися і не дозволять спостерігати препарат). Для цього метода застосовують більш потужні освітлювачі.

Рис. 1. Мікрофотографії живих  клітин печінки миші, отримані різними  методами дослідження: a - світле поле; б - фазовий контраст; в - інтерференційний контраст; г - темне поле, д - флуоресценція (забарвлення акридиновим помаранчевим), е - поляризоване світло; ж-ультрафіолетові промені.

4.3Метод ультрамікроскопія.

В основі методу ультрамікроскопія  лежить той же принцип - препарати  у ультрамікроскопа висвітлюються  перпендикулярно напрямку спостереження. При цьому методі можна виявити (але не «спостерігати» в буквальному  сенсі слова) надзвичайно дрібні частинки, розміри яких лежать далеко за межами роздільної здатності найбільш сильних мікроскопів. За допомогою  імерсійним ультрамікроскопа вдається зареєструвати присутність у  препараті часток з × частинок розміром до 2 × 10 в -9 ступені м. Але  форму і точні розміри таких  допомогою цього методу визначити  неможливо. Їх зображення представляються  спостерігачеві у вигляді дифракційних плям, розміри яких залежать не від  розмірів і форми самих частинок, а від апертури об'єктиву і збільшення мікроскопа. Так як подібні частинки розсіюють дуже мало світла, то для  їх висвітлення потрібні надзвичайно  сильні джерела світла, наприклад  вугільна електрична дуга. Ультрамікроскоп  застосовуються в основному в  колоїдної хімії.

4.4Метод фазового контрасту

Метод фазового контрасту  і його різновид - т. зв. метод «аноптрального» контрасту призначені для одержання зображень прозорих і безбарвних об'єктів, невидимих при спостереженні за методом світлого поля. До таких належать, наприклад, живі незабарвлені тваринні тканини. Суть методу в тому, що навіть при дуже малих відмінностях у показниках заломлення різних елементів препарату світлова хвиля, що проходить через них, зазнає різні зміни по фазі (набуває т. зв. Фазовий рельєф). Не сприймаються безпосередньо ні оком, ні фотопластинкою, ці фазові зміни за допомогою спеціального оптичного пристрою перетворюються на зміни амплітуди світлової хвилі, тобто у зміни яскравості («амплітудний рельєф»), які вже помітні оком або фіксуються на фоточутливому шарі. Іншими словами, в отримуваних видимому зображенні розподіл яскравостей (амплітуд) відтворює фазовий рельєф. Отримувана таким чином зображення називається фазово-контрастним.

 Фазово-контрастна пристрій  може бути встановлене на будь-світловому  мікроскопі і складається з: 

1.Набору об'єктивів зі  спеціальними фазовим пластинками; 
2. Конденсора з поворачивающимся диском. У ньому встановлені кільцеві діафрагми, відповідні фазовим пластинкам в кожному з об'єктивів;

3. Допоміжного телескопа  для налаштування фазового контрасту. 
Налаштування фазового контрасту полягає в наступному:

1.Заміняють об'єктиви  та конденсор мікроскопа на  фазові (позначені літерами Ph); 
2. Встановлюють об'єктив малого збільшення. Отвір в диску конденсора повинно бути без кільцевої діафрагми (позначеної цифрою "0"); 
3. Налаштовують світло по Кьолеру; 
4. Вибирають фазовий об'єктив відповідного збільшення і фокусують його на препарат; 
5. Повертають диск конденсора і встановлюють відповідну об'єктиву кільцеву діафрагму; 
6. Виймають з тубуса окуляр і вставляють на його місце допоміжний телескоп. Налаштовують його так, щоб були різко видно фазова пластинка (у вигляді темного кільця) і кільцева діафрагма (у вигляді світлого кільця того ж діаметра). За допомогою регулювальних гвинтів на конденсорі сполучають ці кільця. Виймають допоміжний телескоп і знову встановлюють окуляр.

Завдяки застосуванню цього  способу мікроскопії контраст живих  нефарбованих мікроорганізмів різко  збільшується і вони виглядають темними  на світлому тлі (позитивний фазовий  контраст) або світлими на темному  тлі (негативний фазовий контраст).

Фазово-контрастна мікроскопія  застосовується також для вивчення клітин культури тканини, спостереження  дії різних вірусів на клітини, і  т. п. У цих випадках часто застосовують біологічні мікроскопи зі зворотним  розташуванням оптики - інвертовані  мікроскопи. У таких мікроскопів  об'єктиви розташовані знизу, а конденсор - зверху.

4.5Метод інтерференційного контрасту

Метод інтерференційного  контрасту складається в тому, що кожен промінь, що входить в  мікроскоп, роздвоюється: один проходить  крізь спостережувану частку, другий - мимо. У окулярної частини мікроскопа обидва променя знову з'єднуються  і інтерферують між собою. Результат  інтерференції визначається різницею ходу променів яка виражається формулою де - показники заломлення об'єкта і навколишнього середовища d - товщина об'єкта, N - порядок інтерференції, - довжина хвилі

Можна сказати, що метод інтерференційного  контрасту схожий з методом фазового контрасту - вони обидва засновані на інтерференції променів, які пройшли крізь мікрочастинку. Як і фазово-контрастна мікроскопія, цей метод дає можливість спостерігати прозорі і безбарвні об'єкти, але їх зображення можуть бути і різнокольоровими (інтерференційні кольори). Обидва методи придатні для вивчення живих тканин і клітин і застосовуються в багатьох випадках саме з цією метою. Головна відмінність інтерференційної мікроскопії від методу фазового полягає в можливості, використовуючи компенсатори, з високою точністю вимірювати різниці ходу. На підставі цих вимірів можна робити кількісні розрахунки, напр, загальної маси і концентрації сухої речовини в клітинах біол. препаратів. В інтерференційних мікроскопах відсутні ореоли,які супроводжують фазово-контрастне зображення; такі мікроскопи дозволяють виявити ділянки об'єкта як з малими, так і великими градієнтами показника заломлення або товщини (рис. 1, в). Однак ці мікроскопи істотно складніше фазово-контрастних у виробництві та експлуатації.

 Метод інтерференційного  контрасту часто застосовують  разом з іншими методами мікроскопії,  зокрема зі спостереженням у  поляризованому світлі. Його застосування  в поєднанні з мікроскопією  в ультрафіолетових променях  дозволяє, наприклад, визначити вміст  нуклеїнових кислот в загальній  сухій масі об'єкта.

4.6 Поляризаційна мікроскопія

Поляризаційна мікроскопія. використовується для дослідження  анізотропних об'єктів у поляризованому. світлі . У прозорих об'єктів спостерігають  інтерференційні. явища ,які вивчаються або в паралельних променях (ортоскопія), або в збіжних променях (коноскопія). При ортоскопічному. ході променів (рис. 2, а) в фокальну площину окуляра 11 проектується зображення 4 'препарату 4. інтерференція поляризованих променів локалізована в площині препарату. Пучок променів, які пройшли через поляризатор 1, обмежується апертурною діафрагмою 2 конденсора 3; за допомогою поворотного аналізатора 8 і компенсаторів різних типів 7 проводиться вимірювання величини подвійного променезаломлення, кутів повороту площини поляризації, визначення кутів погасання та інші характеристики. При коноскопічному  ході променів (рис. 2, б) апертурна діафрагма 2 відкривається, а спостереження інтерференційної. картини, локалізованої в нескінченності, проводиться за допомогою лінзи Бертрана 9,яка проектує вихідну зіницю 6 у фокальну площину 10 окуляра. Отримані при цьому зображення дають можливість визначити знак подвійного променезаломлення, кількість осей об'єкта, їх орієнтацію і величину кута між осями.

У непрозорих об'єктів в  поляризованому. світлі вивчають силу подвійного променезаломлення та інші властивості. Найбільше поширення поляризаційна мікроскопія. отримала в мінералогії, петрографії та кристалографії, але застосовується також для вивчення біол. об'єктів (рис. 1, е).

                                               б

Рис. 2. Принципова оптична схема поляризаційного мікроскопа: a - для ортоскопічного спостереження; б - для коноскопічного спостереження; 1 - поляризатор; 2- діафрагми, 3 - конденсор, 4 - препарат, 5 - об'єктив; 7 - компенсатор, 8 - аналізатор; 9 - лінза Бертрана; 10 - фокальна площина окуляра; 11 - окуляр.

4.7Люмінесцентна мікроскопія

Метод дослідження в світлі люмінесценції (люмінесцентна мікроскопія, або флуоресцентна мікроскопія) полягає в спостереженні під  мікроскопом зелено-помаранчевого  світіння мікрооб'єктів, яке виникає  при їх висвітленні синьо-фіолетовим світлом або не видимими оком ультрафіолетовими  променями. У оптичну схему мікроскопа вводяться два світлофільтра. Один з них поміщають перед конденсором. Він пропускає від джерела-освітлювача  випромінювання тільки тих довжин хвиль, які збуджують люмінесценцію  або самого об'єкта (власна люмінесценція), або спеціальних барвників, введених в препарат і поглинених його частками (вторинна люмінесценція). Другий світлофільтр, який встановлений після об'єктива, пропускає до ока спостерігача (або  на фоточутливому шарі) тільки світло люмінесценції. При люмінесцентній мікроскопії використовують освітлення препаратів як зверху (через об'єктив, який у цьому випадку служить і конденсором), так і знизу, через звичайний конденсор. Спостереження при освітленні зверху іноді називають «люмінесцентної мікроскопії у відбитому світлі» (цей термін умовний - збудження світіння препарату не є простим віддзеркаленням світла). Його часто використовують разом зі спостереженням за фазово-контрастного методу у прохідному світлі. Метод знайшов широке застосування в мікробіології, вірусології, гістології, цитології, в харчовій промисловості, при дослідженні грунтів, в мікрохімічного аналізі, в дефектоскопії. Таке розмаїття застосувань пояснюється дуже високою чутливістю ока і високою контрастністю зображення об'єкта на темному нелюмінесцируючому тлі. Крім того, інформація про склад і властивості досліджуваних речовин, яку можна отримати, знаючи інтенсивність і спектральний склад їх люмінесцентного випромінювання, має величезну цінність.