История изучения ДНК

                         Теория тетрануклеотидного строения нуклеиновых кислот казалась хорошо обоснованной. Она вошла во все учебники того (довоенного) времени как высшее достижение структурной химии нуклеиновых кислот.

         4. Первые доказательства  биологической роли  ДНК

         Итак, в результате химических исследований создана первая теория строения нуклеиновых кислот. Было выяснено, что ДНК и РНК  являются высокомолекулярными веществами. Наступил период, во время которого биологи, не отдавая себе ясного отчета относительно биологической роли нуклеиновых кислот, накапливали сведения об их распространении в различных типах животных и растительных тканей, в бактериях и вирусах, в некоторых одноклеточных организмах.

         Методом Фельгена было показано, что ДНК находится не только в ядрах животных клеток, но и широко распространена в ядрах  растительных клеток.

         В 1936 г. молодой советский  ученый, ставший впоследствии академиком, А. Н. Белозерский впервые препаративно выделил ДНК в чистом виде из растительного материала – из ростков конского каштана.

         Работами Браше, Дэвидсона  и других исследователей в то же время было показано, что РНК всегда встречается в животных клетках. Таким образом, оба вида нуклеиновых кислот оказались присущими как животным, так и растительным организмам [1,4,5]

         Генетика, сформировавшаяся в виде самостоятельной науки  в начале XX в., обобщила к тому времени  многие экспериментальные факты. Были вновь открыты и подтверждены законы Менделя. Была создана теория генов – элементарных единиц наследственности. Некоторыми учеными высказывались мнения о том, что наследственные свойства клеток связаны с каким-то ее материальным субстратом. Однако химическая природа генов оставалась загадкой. Большинство генетиков и биохимиков представляли гены в виде белков или комплексов белков с другими химическими соединениями, в частности с нуклеиновыми кислотами липидами или полисахаридами. Традиционное представление о первичной роли белков в жизненном процессе не позволяло и думать о том, что столь важное вещество, как вещество наследственности, могло быть чем-либо, кроме белка. Магия белка состояла еще и в сложности строения его молекул, их удивительном разнообразии. Известный советский генетик-цитолог Н. К. Кольцов подсчитал, что, варьируя последовательность 20 аминокислот, входящих в состав белковой молекулы, можно создать триллионы непохожих друг на друга белков. «Если бы мы, – писал Кольцов, – захотели напечатать в самой упрощенной форме, как печатаются логарифмические таблицы, этот триллион молекул и предоставили для выполнения этого плана все ныне существующие типографии мира, выпуская в год 50000 томов по 100 печатных листов, то до конца предпринятой работы протекло б столько времени, сколько его прошло с архейского периода до наших дней».

         А вот как пишет  по этому поводу А. Р. Кизель – один из наиболее эрудированных биохимиков, книга которого «Химия протоплазмы» была переведена на многие европейские  языки: «Из только что приведенных воззрений на роли нуклеиновой кислоты... вытекает ее непричастность к строению генов и следует, что гены составлены из какого-то другого материала. Этого материала мы еще достоверно не знаем, несмотря на то, что он в большинстве случаев прямо называется белком».

         Спустя 6 лет по этому  вопросу совершенно в том же духе высказался известный цитолог Б. В. Кедровский: «Белок и ген с разных точек зрения являются центрами ядерной  активности. Внутри соматической клетки гены оказываются локализованными в хромосомах и притом в тех участках их («хромомерах»), которые содержат нуклеопротеид, т. е. соединение гистона с нуклеиновой кислотой. Таким образом, и результата цитологического анализа тесно связывают гены с наиболее типичными и постоянными ядерными белками. Поэтому естественно должна была зародиться мысль об их идентичности, т. е., другими словами, о белковой природе гена. Мысль эта в настоящее время разделяется значительным числом исследователей. Затруднение создают протамины спермиев рыб, которые с этой точки зрения должны являться единственным субстратом факторов наследственности, но вместе с тем чересчур примитивны и однообразны для такой роли по своему химическому строению».

         И вот в этой традиционной области науки один за другим начали появляться новые факты, и по словам академика В. А. Энгельгардта: «В результате мощного взаимного усиления тесно переплетающихся линий исследования в огромной степени возрос фронт аналитического изучения коренных явлений жизни... В короткий срок, на протяжении полутора-двух десятилетий возникла новая наука, молекулярная биология, которая и произвела подлинную революцию во многих важнейших областях биологии». Прогресс биологии оказался тесным образом связанным с усовершенствованием техники экспериментов, появлением электронных микроскопов, тонких методов разделения белков и нуклеиновых кислот, кристаллизацией ферментов, применением радиоактивных изотопов [1,4,10]

         Первый успех пришел из микробиологии. В 1944 г. были опубликованы результаты опытов Эвери и сотрудников (США) по трансформации бактерий. Явление трансформации было открыто в 20-х годах нашего столетия микробиологом Гриффитсом (Англия). Гриффитс работал с пневмококками (бактериями, вызывающими пневмонию) и пытался понять природу их вирулентности. К тому времени пневмококки удалось разделить на ряд форм. Всего существовало несколько типов пневмококков, каждый из которых синтезировал специфический полисахарид клеточной оболочки — капсулы с характерными серологическими и химическими свойствами. В 1928г. Гриффитс обнаружил, что один штамм пневмококка, культивируемый в особых условиях in vitro, утратил способность к синтезу своего полисахарида и поэтому рос на твердой среде в виде так называемых складчатых колоний (R-формы), отличных от гладких, блестящих колоний клеток, имеющих капсулы (S-формы).

         Эвери и сотрудники поставили перед собой задачу выяснить химическую природу трансформирующего  агента. Они разрушали суспензию  пневмококков дезоксихолатом и удаляли  из экстракта белки, капсульный полисахарид  и РНК, однако трансформирующая активность экстракта сохранялась. Активную субстанцию можно было несколько раз переосаждать спиртом. Это вещество было идентифицировано Эвери по цветной реакции как ДНК. Трансформирующая активность препарата не терялась при его обработке кристаллическим трипсином или химотрипсином, панкреатической рибонуклеазой. Было ясно, что препарат не являлся ни белком, ни РНК. Однако трансформирующая активность препарата полностью утрачивалась при обработке его панкреатической дезоксирибонуклеазой, причем ничтожные количества фермента вызывали полную инактивацию препарата. Таким образом, было установлен но, что трансформирующий фактор у бактерий является чистой ДНК. Этот вывод явился значительным открытием, и Эвери отлично сознавал это. Он писал, что это как раз то, о чем давно мечтали генетики, а именно вещество гена. Опыты Эвери показали, кроме того, что различные штаммы бактерий даже одного вида различаются по своей ДНК. Впоследствии многочисленные эксперименты подтвердили опыты Эвери, но и оппозиция, не желавшая признавать ДНК веществом гена, была очень сильна. Полагали, что трансформацию могут вызывать и те ничтожные примеси белка, которые оставались в препарате. Новым доказательством прямой генетической роли ДНК явились опыты вирусологов Херши и Чейз. Им удалось включить в состав ДНК и белка бактериофага Т2, который заражает бактерию Escherichia coli (кишечную палочку), радио­активные изотопы фосфора и серы. При этом ДНК фага метилась Р, а белок фага – S. Используя такой фаг с двойной меткой, они показали, что при фаговом заражении клеток Е. coli внутрь бактериальной клетки проникает в основном только фаговая ДНК и лишь ничтожное количество белка фага. Основная масса вирусного белка остается снаружи бактериальной клетки. Эта ДНК фага Т2 затем обеспечивает синтез себя самой, а также синтез белков фага Т2 в больших количествах внутри клетки-хозяина. Из полученных ДНК и белков вновь собираются характерные фаговые частицы.

         Открытие Эвери  того факта, что бактериальная ДНК  является фундаментальным принципом трансформации бактерий, оказало влияние на биологов и биохимиков послевоенного времени. В числе последних был биохимик Э. Чаргафф. В статье, посвященной столетию со времени открытия нуклеиновых кислот, он писал, что ни на одного исследователя выводы Эвери не оказали большего влияния, чем на него. Из темноты перед ним начали вырисовываться контуры грамматики в биологии. Чаргафф считал, что Эвери дал современникам первый текст нового языка, вернее, показал им, где искать этот язык. В лаборатории биохимии Колумбийского университета в Нью-Йорке Чаргафф решил начать поиски нового языка. Он начал с идеи о том, что если различные виды ДНК проявляют различную биологическую активность, то тогда обязательно должны существовать различия и в химическом составе нуклеиновых кислот. По аналогии с идеями и данными химии белка Чаргафф принялся искать разницу в нуклеотидном составе и расположении нуклеотидов в препаратах ДНК, полученных из различных источников. Методы, позволяющие точно дать химическую характеристику ДНК, в то время отсутствовали. Такие методы были развиты Чаргаффом, и они дали удивительные результаты. Оказалось, что старая тетрануклеотидная теория строения нуклеиновых кислот неверна. Существует на самом деле огромное количество различных ДНК, отличающихся по составу и расположению оснований и характеризующих данный вид. При этом обнаружились новые факты, не установленные ранее для других природных полимеров, а именно регулярности в соотношении отдельных оснований в составе всех исследованных ДНК. Хотя разные ДНК и различались значительно по своему нуклеотидному составу, все они подчинялись определенным общим правилам. Поразительным оказалось то, что в каждом образце ДНК число молекул аденина было равно числу молекул тимина, а гуанина – молекул цитозина.

         Правила Чаргаффа

         Первое правило  Чаргаффа: А/Т = Г/Ц = 1.

         (Здесь А, Т,  Г и Ц соответствуют молярным  процентам соответствующих азотистых  оснований, приходящимся на 100 грамм-атомов  фосфора ДНК. В ряде образцов  ДНК, кроме цитозина, обнаруживается 5-метилцитозин, который при подсчетах включают в цитозин. В ДНК, выделенных из бактериофагов (вирусов) Т2, Т4 и Т6, вместо цитозина имеется 5-гидроксиметилцитозин. Он встречается и в других вирусах.)

         Второе правило  Чаргаффа: А+Г=Ц+Т, т. е. количество пуринов  в ДНК равно количеству пиримидинов.

         Третье правило  Чаргаффа: A+Ц=Г+T, т. е. количество оснований  с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с 6-кетогруппами.

         Чаргафф не смог полностью  объяснить своих правил, основанных на результатах тщательной аналитической работы с различными образцами ДНК. Однако уже в 1953 г. это сделали молодые ученые Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик. Они создали структурную модель молекулы ДНК, которая полностью соответствовала ограничениям в нуклеотидном составе ДНК согласно правилам Чаргаффа. 
 
 
 
 
 

         5. История открытие  структуры ДНК

        «Здесь в Кембридже  произошло, быть может, самое выдающееся после книги Дарвина событие  в биологии – Уотсон и Крик раскрыли структуру гена!»

        М. Дельбрюк. 

         В начале 1950-х годов  стали известны два новых факта, пролившие свет на природу ДНК: американский химик Лайнус Полинг (Linus Pauling, 1901–94) показал, что в длинных молекулах, например белках, могут образовываться связи, закручивающие молекулу в спираль, а в лондонской лаборатории Морис Уилкинс и Розалинда Франклин получили данные рентгеноструктурного анализа (основанные на усовершенствованном применении закона Брэгга), позволившие предположить, что ДНК имеет спиральную структуру.

         Как раз в это  время молодой американский биохимик Джеймс Уотсон отправился на год в  Кембриджский университет для работы с молодым английским физиком-теоретиком Фрэнсисом Криком. («Обо мне тогда практически никто не знал, — вспоминал впоследствии Крик, — а идеи Уотсона считали... слишком заумными».) Экспериментируя с металлическими моделями, Крик и Уотсон пытались объединить различные компоненты молекулы в трехмерную модель ДНК [3].

         Чтобы лучше представить  себе полученные ими результаты, вообразите длинную лестницу. Вертикальные стойки этой лестницы состоят из молекул  сахара, кислорода и фосфора. Важную функциональную информацию в молекуле несут ступеньки лестницы. Они состоят из двух молекул, каждая из которых крепится к одной из вертикальных стоек. Эти молекулы — четыре азотистых основания — представляют собой одиночные или двойные кольца, содержащие атомы углерода, азота и кислорода и способные образовывать две или три водородные связи (см. Химические связи) с другими основаниями. Форма этих молекул позволяет им образовывать связи — законченные ступеньки — лишь определенного типа: между А и Т и между Г и Ц. Другие связи возникнуть не могут. Следовательно, каждая ступенька представлена либо А—Т либо Г—Ц. Теперь вообразите, что вы берете собранную таким образом лестницу за два конца и скручиваете — вы получите знакомую двойную спираль ДНК.

         Считывая ступеньки  по одной цепи молекулы ДНК, вы получите последовательность оснований. Представьте, что это сообщение, написанное с помощью алфавита всего из четырех букв. Именно это сообщение определяет химические превращения, происходящие в клетке, и, следовательно, характеристики живого организма, частью которого является эта клетка. На другой цепи спирали никакой новой информации не содержится, ведь если вам известно основание, которое находится на одной цепи, вы знаете и то, какой должна быть вторая половина ступеньки. В некотором смысле две цепи двойной спирали относятся друг другу так же, как фотография и негатив [3].

         Открыв двуспиральную  структуру ДНК в 1953 году, Уотсон и Крик поняли и тот простой способ, которым осуществляется воспроизведение молекулы ДНК — как и должно, происходить при делении клетки. «Мы предлагаем вашему вниманию структуру ДНК, имеющую некоторые новые свойства, которые представляют значительный биологический интерес...» Так начиналась статья Уотсона и Крика в номере международного научного журнала «Нейчер» от 27 апреля 1953 г. В этой статье они предлагали модель двухцепочечной спирали ДНК, похожей на винтовую лестницу, ступеньками которой являются комплементарные пары А – Т, Г – Ц. «Перилами» лестницы служат молекулы сахара дезоксирибозы, а соединяются нуклеотиды в цепочку при помощи фосфорной кислоты. Схематически это выглядит следующим образом, где Ф. – остаток фосфорной кислоты (рис.5) 

         Рисунок – 5. Схема двуцепочной молекулы ДНК