История изучения ДНК

         Таким образом, существование нового типа вещества в ядрах клеток вызвало борьбу идей ученых того времени относительно их биологической роли.

         2. Представления ученых о биологической роли нуклеина

         Фридрих Мишер, как  уже упоминалось выше, неясно представлял  себе биологическую роль нуклеина. Это неудивительно, так как роль самого ядра в клетке была еще неясна, хотя оно было открыто шотландским путешественником и физиком Робертом Броуном  в 1831 году. Не только Мишер, но и известный биолог В. Флемминг в 1882 г., описывая последние работы по ядру клетки, делал вывод, что относительно биологического значения ядра ученые остаются до сих пор в полной темноте. Правильные идеи относительно роли нуклеина пришли в это время со стороны тех биологов, которые занимались изучением процесса оплодотворения. Мишер выделил нуклеин, в частности, из сперматозоидов, т. е. клеток, осуществляющих оплодотворение яиц и принимающих таким образом участие в зарождении нового организма с наследственными признаками, передающимися ему от родителей. Этот факт уже указывал на возможное значение ядра и нуклеина в процессе передачи наследственных признаков. Действительно, проведенные в это время микроскопические исследования процесса оплодотворения яиц морского ежа и аскариды убедительно показали, что при слиянии ядер яйцеклетки и сперматозоида в яйцеклетке оказываются половинные наборы хромосом как яйца, так и сперматозоида, которые редуплицируются, т. е. удваиваются. После этого яйцеклетка делится на две идентичные клетки нового организма, причем в каждой клетке оказывается полный (диплоидный) набор хромосом, половина которого произошла от хромосом матери, а половина – от хромосом отца. Большинство ученых приняло тогда ту точку зрения, что хромосомы передают генетический материал и осуществляют наследственную непрерывность в ряду поколений [1,4]

         Так как хромосомы  находятся в ядре, было высказано  предположение, что они содержат нуклеин. Далее можно было предполагать, что нуклеин является веществом, ответственным за передачу наследственных признаков от клетки к клетке. Ботаник Захариас в 1881 г. экспериментально показал, что нуклеин действительно содержится в хромосомах. Он исследовал хроматин, ядерный материал, окрашивающийся теми же красителями, что и хромосомы. Ученый удалял нуклеин из ядер, пользуясь процедурой, разработанной Мишером. При этом ядра и хроматин теряли способность окрашиваться. Эти опыты были поставлены на различных клетках как растительного, так и животного происхождения. Захариас показал также, что если переваривать клетки пепсином в процессе клеточного деления, то из клеток удалялось веретено, но хромосомы оставались и были способны окрашиваться. Однако после обработки этих клеток разбавленной щелочью хромосомы полностью переставали окрашиваться. После этих опытов Флемминг признал роль нуклеина как вероятного субстрата наследственности. Другие ученые разделили его точку зрения. Так, в 1884 г. зоолог Гертвиг писал, что нуклеин, вероятно, является веществом, ответственным не только за оплодотворение, но и за передачу наследственных характеристик в ряду поколений [1,7].

         Хотя биологическая  роль нуклеина оставалась неясной, изучение химического состава нуклеина продолжалось, хотя и медленно.

         3. Изучение химического  состава нуклеина

          Исследованием химического состава нуклеина, полученного  Мишером, занялся другой ученик Гоппе-Зейлера – Альбрехт Коссель (рис.3)

Рисунок-3

         Выбор этой темы не определялся  тем, что Коссель понимал биологическую  роль нуклеина или предвидел его  значение в будущем. Это была совершенно нетронутая область. Здесь Коссель не имел ни предшественников, ни конкурентов. Коссель использовал метод гидролиза – общепринятый среди химиков метод при анализе сложного вещества. Время работы Косселя совпало с расцветом исследований природных соединений – полисахаридов, белков и липидов, а также алкалоидов и красителей. Метод заключался в том, что сложное природное соединение сначала кипятилось в кислой среде, затем гидролизат выпаривался и образующиеся низкомолекулярные продукты гидролиза кристаллизовались и идентифицировались. Коссель выделил из продуктов гидролиза нуклеиновых кислот ранее неизвестные химикам вещества — азотистые основания аденин и ксантин. Был выделен также уже известный гуанин. Его получали из гуано (экскрементов птиц). Эти соединения относились к пуринам; к пуринам же относилась мочевая кислота, известная еще в XVIII в. Как раз в конце XIX века знаменитый современник Косселя Эмиль Фишер и ряд других исследователей разработали структурную химию этих соединений. Впоследствии было показано, что в состав нуклеиновых кислот входят только аденин и гуанин, а ксантин получился из них в результате химического превращения при гидролизе. Затем Косселем и его учениками были выделены из гидролизатов нуклеиновых кислот азотистые основания тимин и цитозин, относящиеся к пиримидинам. Урацил из дрожжевой нуклеиновой кислоты был выделен Асколи в 1900 г [2].

         (Термин «пурин»  ввел в науку Фишер от слов  «purum» и «uricum». Термин «пиримидин»  является комбинацией слов «пиридин» и «амидин». Кроме этих соединений, в гидролизате всегда находилось большое количество неорганической фосфорной кислоты и какого-то углевода.)

         Азотистые пуриновые  основания имели структуру, близкую  к структуре известной мочевой  кислоты, постоянно содержащейся в моче. Ее содержание в моче резко уменьшается при подагре вследствие того, что мочевая кислота откладывается в суставах. Основное значение своих открытий Коссель видел как раз в установлении связи между аденином и гуанином нуклеиновых кислот и мочевой кислотой. Он был первым ученым, получившим за работы в области нуклеиновых кислот Нобелевскую премию. В официальном документе, формулирующем основания для присуждения премии, было написано, что открытие в нуклеиновых кислотах аденина и гуанина объясняет происхождение нормального продукта обмена, выделяющегося через почки, – мочевой кислоты. Теперь мы хорошо понимаем, что установление связи между нуклеином и подагрой – дело нужное, однако оно не может конкурировать с ролью нуклеиновых кислот в передаче наследственных свойств клетки [2,6,7]

         Результаты исследований Косселя и увенчание их премией  способствовали распространению сведений о нуклеиновых кислотах среди  врачебных кругов. Практическим выводом  для медицины из этих работ явилась  рекомендация для больного подагрой употреблять в пищу меньше тех продуктов, которые содержат много ядер и, следовательно, много нуклеина. Во все времена общество относится недоброжелательно к исследованиям, носящим чисто отвлеченный, оторванный от практики характер, и проявляет восхищение, когда в теоретических изысканиях обнаруживается какой-то практический смысл.

         Кроме идентификации  некоторых продуктов гидролитического расщепления нуклеиновой кислоты, важная заслуга Косселя состоит  в открытии белка со щелочными  свойствами в ядрах клеток разных тканей. Выше уже говорилось о протамине, обнаруженном Мишером в молоках рыб, и о том, что, по его предположению, нуклеиновая кислота находится в ядрах в солеобразном соединении с протамином. В сперме быка, а также в незрелой сперме лосося Мишер не смог обнаружить протамина. Белки, выделенные Косселем из ядер многих тканей, играли, по-видимому, ту же роль, что и протамин. Ученый предложил для обнаруженного им белка название «гистон» (от «histos» — ткань, греч.).

         В лаборатории Косселя  нуклеиновые кислоты научились выделять из многих источников. В больших количествах, необходимых при лабораторной практике того времени, их легко получали из зобной железы (тимуса) теленка и из дрожжей. Было установлено, что эти кислоты отличаются друг от друга по пиримидиновому основанию. Нуклеиновая кислота зобной железы теленка – тимонуклеиновая кислота – содержала тимин, а дрожжевая нуклеиновая кислота – урацил вместо тимина. Поскольку тимонуклеиновая кислота была выделена из животных клеток, распространилось убеждение, что она характерна для объектов животного происхождения, в то время как дрожжевая нуклеиновая кислота — для объектов растительного происхождения. Таким образом, возникло представление о химическом различии в составе ядерного материала растительной и животной клеток. Эта точка зрения впоследствии оказалась неверной.

         Дальнейшее исследование состава и структуры нуклеиновых  кислот проводилось в лаборатории  уроженца России Петра Левена в США  и в ряде других лабораторий. Первые работы Левена и сотрудников были посвящены изучению состава и строения углеводного компонента нуклеиновой кислоты. Сначала был выделен в кристаллическом виде углеводный компонент дрожжевой нуклеиновой кислоты. Он оказался моносахаридом необыч­ного строения – пентозой, которую назвали D-рибозой. Этот сахар был неизвестен к тому времени химикам, он встречался только в нуклеиновой кислоте. Впоследствии L-рибоза, а затем и D-рибоза были синтезированы Фишером и другими исследователями, а затем и закристаллизованы. Эта синтетическая кристаллическая D-рибоза оказалась химически тождественной сахару, выделенному из дрожжевой нуклеиновой кислоты.

         Выделить углеводный компонент тимонуклеиновой кислоты  оказалось сложной задачей. Левен  решил ее, используя мягкий ферментативный метод деградации тимонуклеиновой кислоты сначала на большие фрагменты, затем из них умеренным гидролизом получали дезоксирибозу в кристаллическом виде. 2-Дезокси-О-рибоза была также получена синтетическим путем, и оказалось, что эта последняя идентична природной 2-дезокси-D-рибозе. Никаких других простых моносахаров в нуклеиновых кислотах не было найдено, хотя исследовались сотни препаратов из самых различных источников.

         После идентификации  рибозы и дезоксирибозы нуклеиновые  кислоты получили новые названия. Те, которые содержали рибозу, стали называть рибонуклеиновыми кислотами или, сокращенно, РНК, а те, которые содержали дезоксирибозу, стали называть дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или ДНК.

         Итак, после идентификации  углеводного компонента все низкомолекулярные  вещества, входящие в состав нуклеиновых кислот, стали известными, и естественно возник вопрос, как они соединены между собой в молекуле природной нуклеиновой кислоты [2,6,7].

         Для изучения этой проблемы, следуя примеру Фишера, Левен проводил гидролиз ДНК не грубым многочасовым кипячением сильно подкисленных растворов, а в более мягких условиях – при уменьшении концентрации кислоты или при сокращении времени гидролиза. Еще более удачные результаты были получены при гидролизе ДНК с помощью ферментов. В то время еще не были выделены гомогенные препараты ферментов, разлагающих нуклеиновые кислоты, или нуклеазы. В качестве ферментов Левен брал фракцию желудочного сока животного. Нуклеазы работали в слабощелочной или нейтральной среде, т. е. в особенно мягких условиях. Теперь из гидролизатов удавалось выделить не только отдельные аденин, гуанин, тимин, цитозин, дезоксирибозу и фосфорную кислоту, но и более крупные фрагменты, например соединения азотистых оснований с углеводом или углевода с фосфорной кислотой. Вместе с тем в гидролизатах нуклеиновых кислот никогда не были обнаружены соединения, состоящие из двух азотистых оснований, или соединения типа основание – фосфорная кислота. Соединения азотистых оснований с углеводом было предложено называть нуклеозидами.

         При исследовании структуры рибо- и дезоксирибонуклеозидов было обнаружено, что они являются β-D-рибофуранозидами и 2-0-дезоксирибофуранозидами. Присоединение сахара к азотистому основанию происходит в положении 9 пуринов и в положении 3 пиримидинов.

         Выделение нуклеозидов и фосфорилированной пентозы из гидролизатов нуклеиновых кислот указывало, что в нуклеиновых кислотах азотистое соединение связано с пентозой, а последняя – с фосфорной кислотой. Действительно, Левену удалось выделить из гидролизатов РНК, полученных при действии, разбавленной щелочи, фосфорные эфиры нуклеозидов – адениловую, гуаниловую, уридиловую и цитидиловую кислоты. Фосфорные эфиры нуклеозидов назвали нуклеотидами. Как видно, нуклеотиды различаются между собой только характером азотистого основания. Поэтому их именуют по азотистому основанию. Положение фосфорного остатка нуклеотидов, полученных при действии разбавленной щелочи на РНК, может быть различным – он может находиться в положении 2', 3' или 5'. Из гидролизатов ДНК также удалось выделить фосфорные эфиры дезоксирибонуклеозидов, т. е. дезоксирибонуклеотиды. Пиримидиновые дезоксирибонуклеотиды получали мягким кислотным гидролизом ДНК, пуриновые дезоксирибонуклеотиды — при деградации ДНК с помощью ферментов. Работа по изучению структуры выделенных из ДНК и РНК нуклеозидов и нуклеотидов отняла у химиков много лет. Каждое соединение было закристаллизовано, идентифицировано, изучены его растворимость и химические свойства. В результате этих работ Левен пришел к выводу, что нуклеиновые кислоты являются полимерами. В качестве мономеров служат нуклеотиды. Содержание каждого из четырех нуклеотидов в ДНК или РНК, по данным химического анализа того времени, представлялось Левену равным. Поэтому Левен предложил следующую теорию строения нуклеиновых кислот: они являются полимерами, мономерами которых служат блоки из четырех нуклео­тидов, соединенных последовательно.

         Что касается связей между нуклеотидами, то было предположено и рядом экспериментов подтверждено, что нуклеотиды соединяются между собой фосфодиэфирными связями [9].

         Остаток фосфорной  кислоты образует фосфоэфирную связь  в положении 3' одной пентозы и 5' другой. При действии нуклеаз, получаемых в то время в неочищенном виде из различных источников, главным  образом из ядов змей и поджелудочной  железы животных, удалось выделить из гидролизатов нуклеиновых кислот как нуклеозид-6-фосфаты, так и нуклеозид-3-фосфаты. Постепенно число выделенных и очищенных нуклеаз росло, и они стали главным инструментом изучения связи нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Браун и Тодд использовали панкреатическую рибонуклеазу, закристаллизованную в 1940 г., для изучения структуры РНК и подтвердили наличие в основном 3'–5'-фосфодиэфирных связей в РНК. Иногда в РНК наблюдались разветвленные структуры, отличные от линейной цепочки, образованной связями. В этом случае предполагалось, что фосфоэфирная связь образуется и в положении 2'. Что касается ДНК, то там большинством методов были обнаружены только 3'–5'-фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. Разветвления в структуре ДНК почти отсутствовали. Из гидролизатов ДНК при действии панкреатической дезоксирибонуклеазы и диэстеразы змеиного яда Тодд и его сотрудники получали преимущественно (92%) дезоксирибонуклеозид-6-фосфаты, что свидетельствовало о   широком распространении 5'-фосфоэфирной связи с ДНК.