История изучения ДНК

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение 

Изучая  истину, можно иметь троякую цель: открыть истину,

когда ищем ее; доказать ее, когда нашли;

наконец, отличить от лжи, когда ее рассматриваем. 

Блез  Паскаль 

      Прошло  много времени, пока люди узнали, что  существует такие вещества как нуклеиновые  кислоты, что они содержаться  во всех живых организмах от микробов до высших форм жизни. И, наконец, произошло  открытие, так в 1869 году швейцарский  физиолог, гистолог и биолог Фридрих Мишер открыл  ДНК, в начале это вещество получило название нуклеин, а позже когда Мишер, определил, что это вещество обладает кислотными свойствами, вещество получило название нуклеиновая кислота. С момента открытия ДНК, прошло на данный момент времени 142 года. За это время ученые мира добились немалых успехов в изучении ДНК. В период времени от открытия ДНК до открытия ее структуры прошли долгие 84 года. И самым запоминающимся открытием является открытие двойной структуры ДНК, это открытие обязано американскому ученому Д.Уотсону и английским ученым Ф.Крику и М.Уилкинсу.

      Но  прежде чем, произошли данные открытия, прошло немало времени и   исследований в области изучения  нуклеиновых  кислот.

      В данной работе,  я  попытаюсь охватить этот весь бурный период времени, насыщенный различными экспериментами, исследованиями Ф.Мишера, Д.Уотсона, Ф.Крика и М.Уилкинса, а также и другими немало важными ученными  работавшие в этой области исследования. 
 
 
 
 
 
 

      Литературный  обзор

      1. Открытие и изучение нуклеина 

      Я придерживаюсь того мнения, что каждое сложное явление мира

      живого  может быть понято только путем синтеза  сведений, полученных

      при изучении менее сложного, а это  последнее, в свою очередь,

      на  основании данных о чем-то еще  более простом.

      Ф.Мишер

      

Рисунок-1 

            Исследования в  области нуклеиновых кислот привели  к созданию и бурному развитию ряда новых биологических дисциплин  – молекулярной биологии, бионики, биокибернетики, вызвали мощный приток научных сил к исследованиям  в биологии.

         Так, открытие нуклеиновых кислот связано с именем молодого врача из города Базеля (Швейцария) Фридриха Мишера (рис.1). Его дядя, профессор анатомии Вильгельм Гис (рис.2)., выдающийся ученый и педагог того времени, оказал на молодого Мишера большое влияние. После окончания медицинского факультета Мишер был послан для усовершенствования и работы над диссертацией в Тюбинген (Германия) в физиолого-химическую лабораторию, возглавляемую Ф. Гоппе-Зейлером.

         Тюбингенская лаборатория  в то время была известна ученому  миру. В ней проводились работы по химическому анализу тканей животного организма. Пройдя практику по органической химии, Мишер приступил к работе в биохимической лаборатории. Ему было поручено заняться изучением химического состава гноя. Молодой ученый не возражал против предложенной темы, так как считал лейкоциты, присутствующие в гное, одними из самых простых клеток [1].

Рисунок-2 

         Для получения материала  пришлось связаться с хирургическим  отделением местной больницы, где  собирались бинты, снятые с больных  при перевязках. Мишер вымачивал бинты в разбавленных солевых растворах, и гнойные клетки (лейкоциты) осаждались на дно сосуда.

         Получив гнойные  клетки, Мишер выдерживал их в течение  некоторого времени в разбавленном солевом растворе. Исходя из опыта  лаборатории, он знал, что при этом протоплазма клеток постепенно растворяется. Из нерастворившегося осадка, который, по его представлениям, подтвержденным микроскопическими исследованиями, являлся осадком ядер клеток, Мишер экстрагировал слабым раствором соды вещество, которое выпадало в осадок при нейтрализации. Это вещество не распадалось при действии протеолитических ферментов и содержало большое количество фосфора, не экстрагируемого горячим спиртом [1].

         Молодой исследователь  сразу понял важность получения  нового органического фосфорсодержащего вещества ядерного происхождения. Он был уверен именно в ядерном его источнике. Поэтому Мишер предпринял более тщательное выделение ядер. В то время еще никто в биохимических лабораториях не пытался выделить ядра или какие-либо другие субклеточные компоненты, так что и здесь он был пионером. При микроскопическом наблюдении препарата оказалось, что ядра были загрязнены другими клеточными фрагментами. Чтобы далее их очистить, Мишер стал добавлять в слабый раствор соляной кислоты экстракт из желудка свиньи, содержащий протеолитический фермент пепсин. Полученные таким образом ядра выглядели несколько сжатыми, но были свободны от цитоплазматического загрязнения. Далее он промывал ядра и обрабатывал их горячим спиртом для удаления липидов, затем препарат ядер экстрагировал разбавленным раствором соды и осаждал осадок после нейтрализации раствора добавлением кислоты. Полученный препарат легко растворялся в щелочи. Новое вещество было подвергнуто элементарному анализу

         Приведу  цитату из труда  Ф.Фишера «О химическом составе клеток гноя»: «Полученное вещество  содержало азот, серу и было очень богато фосфором. Классическая идея о фосфорсодержащем белке получила реальное подтверждение.

         I. 0,1915 г растворимого  нуклеина давали 0,1811 Pt=13,47 N. Ядра после выделения не экстрагировали спиртом. В приводимых ниже исследованиях использовались целые ядра, предварительно  обработанные горячим спиртом.

 П. 0,2278 г давали 0,2378 г Pt=14,60°/o N. По недосмотру некоторое  количество хлорида платины разложилось при выпаривании.

 III. 0,2545 г давали 0,2518 г Pt=13,99% N.

 IV. 0,1862 г давали 0,1810 г Pt=13,97% N.

 V. 0,3882 г давали при  сжигании с ацетатом  калия и селитрой 0,0494 г 

 BaSO4=2,005% S.

 VI. 0,4611 г давали BaS04 0,0598 г=1,78% S.

 VII. 0,2453 г давали BaS04 0,0318 г=1,77% S.

 VIII. 0,3882 г давали  0,0350 г=5,76% Р205.

XI. 0,4611 г давали   0,0430 г=5,96% Р205.

      Я полагаю, что на основании  результатов приведенных  анализов, как бы неполны они ни были, можно сделать  вывод, что мы имеем дело не с какой-то произвольной смесью, а с химически индивидуальным  веществом или по крайней мере с группой близкородственных веществ, если не считать небольшого количества примесей. Об этом свидетельствует также близкое соответствие содержания азота в растворимом нуклеине а целых ядрах, за исключением одного весьма незначительного  отклонения при получении, которое должно было привести к снижению в  содержании азота. На основании чисто количественного исследования можно было думать о соединении лецитина с белком или производным белка примерно так, как мы себе представляем вителлин или хитин. Однако наличие 5,8% Рг05 и 14% азота в одном веществе заставляет сразу же отказаться ют такого допущения. Перед нами скорее особое вещество, не сравнимое ни с одной из ныне известных групп.» [2]

         Мишер использовал  также указания цитологов о сродстве ядер клеток к основным красителям. Препарат Мишера давал интенсивно окрашенный осадок с основным красителем метиловым зеленым. После этих экспериментов Мишер уже не сомневался в том, что он выделил субстанцию ядерного происхождения. Поскольку оно не разлагалось протеолитическими ферментами, новое вещество не являлось белком. Отсутствие растворимости в горячем спирте указывало на то, что это вещество не являлось и фосфолипидом. По-видимому, оно относилось к новому классу биохимических соединений. Ввиду ядерного происхождения Мишер предложил для него название «нуклеин» (лат. «нуклеус» – ядро) [1].

         К открытию нуклеина руководитель лаборатории Гоппе-Зейлер отнесся скептически. Гоппе-Зейлеру казалось маловероятным существование в ткани каких-либо новых веществ, кроме уже давно и хорошо известных – белков, углеводов, липидов. Из известных веществ высокий процент фосфора содержался в так называемых фосфолипидах (фосфатидах). Полученный нуклеин Гоппе-Зейлер склонен был трактовать как соединение белка с примесью фосфатидов. На памяти Гоппе-Зейлера и прежде в лаборатории были случаи, когда молодыми учеными делались «открытия», которые через короткое время бесславно «закрывались», так как часто новое и необычное оказывалось результатом грязной или спешной работы или технической ошибки. Гоппе-Зейлер был осторожный, очень опытный исследователь. Он дорожил репутацией своей лаборатории и не мог допустить публикации сомнительных или недостоверных данных. Но Мишер с большой горячностью настаивал на точности своих результатов и добивался разрешения опубликовать их в печати. Тогда Гоппе-Зейлер решил проверить данные Мишера лично. Он и два его ассистента (одним из них был русский химик Любавин) в течение года шаг за шагом прошли все этапы аналитической работы Мишера и полностью подтвердили его данные, выделив нуклеин из клеток крови и из дрожжей. В 1871 г. работа Мишера вместе с подтверждающими ее контрольными работами Гоппе-Зейлера и его ассистентов увидела свет. Существование нуклеина как специфического ядерного вещества стало научным фактом. Вскоре методика Мишера была применена для выделения нуклеина из различных тканей. Наличия нуклеина с точки зрения ученого нельзя было ожидать в эритроцитах млекопитающих, так как в них нет ядер [1].

           
 
 
 

         В наше время, когда  исключительная роль нуклеиновых кислот известна каждому, понятно громадное значение пионерской работы Мишера. Но в то время ни он сам, ни Гоппе-Зейлер не имели ясного представления о настоящем значении этих исследований и не могли предвидеть их значение в будущем. Именно поэтому дальнейшее развитие исследований по нуклеину подвигалось медленно. Все это хорошо иллюстрирует не раз высказанную мысль, что исследователь и его современники нередко не осознают полностью значения выполняемого исследования, но, если оно произведено правильно и полученные результаты отражают объективную реальность, оно рано или поздно найдет истинное место в науке.

         Год работы в лаборатории  Гоппе-Зейлера окончился для Мишера осенью 1869 г., и он вернулся в Базель. Здесь он решил выделить нуклеин из ядер других клеток. Мишер искал ткань, в которой ядра составляли бы относительно большую часть объема клеток. Из гистологии Мишер знал, что такими клетками являются сперматозоиды. Сперматозоид состоит из головки и тоненького хвостика. Головка представляет почти чистое ядро, цитоплазмы в сперматозоиде относительно мало. Сразу же нашелся и источник сперматозоидов – молоки рейнского лосося. В своей работе «Физиолого-химическое исследование молоки лосося», Ф.Мишер писал: «Уже в 1871 г. меня заинтересовали так называемые молоки лосося, которые могут быть выделены в виде белой как снег, сметанообразной  жидкости из живых или только что убитых самцов лосося и представляют собой исключительно чистую сперму; оказалось, что эти молоки состоят из одних лишь сперматозоидов (без какой-либо примеси: незрелых или иных структурных элементов), которые суспендированы  в содержащей соли жидкости, практически не содержащей растворенных компонентов органической природы. Таким образом, здесь мы получаем объект, исключительно удобный для гистохимических исследований,  материал, работа с которым обещала обнаружение новых ценных фактов и разработку более глубоких представлений о химическом строении клетки и ядра; этими соображениями объясняется целесообразность  предпринятых работ, несмотря на большие специфические трудности, которые  приходилось преодолевать, имея дело именно с этим материалом» [2].

          Эти клетки  содержали огромные ядра, где  было сосредоточено более 90% клеточного материала. Исследования молок, выполненные Мишером в 1873–1874 гг., дали новые важные результаты. Следует отметить, что в это время ученый был так занят преподавательской деятельностью, что мог проводить химические анализы только по ночам и воскресеньям.     

         Мишер изолировал из молок рейнского лосося высокоочищенный  нуклеин, который ему удалось  разделить на составные части: белковоподобный  компонент, обладающий щелочными свойствами, и остаток, не содержащий белка. Этот остаток содержал высокий процент фосфора, который нельзя удалить горячим спиртом, и обладал кислотными свойствами. Белковоподобный компонент нуклеина исследователь назвал протамином. Свободный от белка остаток нуклеина был назван в 1889 г. нуклеиновой кислотой. Это название оказалось удачным и сохранилось до настоящего времени. В ядрах молок рыб присутствовали, таким образом, и нуклеиновая кислота, и щелочной протамин. Мишер высказал предположение, что оба эти вещества находятся в ядрах в комплексе: они нейтрализуют друг друга, образуя солеобразное соединение. Он понимал, что нуклеиновая, кислота является высокомолекулярным соединением, так как препараты этого вещества не проходили через пергаментные фильтры. Ему было также ясно, что для получения хороших препаратов нуклеина работу по его выделению нужно проводить на холоде [1].