Аминокислоты, пептиды и белки, получение и применение в продуктах функционального питания

1.2 Способы получения белков

Белки, как правило, производят в виде трех основных типов продуктов, различающихся по содержанию белка и степени его очистки. Так, белки семян масличных культур выпускают в форме обезжиренной муки семян (содержит около 50% белка), концентрата и изолята белка (содержат соответственно 70—75 и 90— 99% белка). Аналогичные виды продуктов производят и из других источников, например из малоценных пород рыбы (рыбная мука, концентраты и изоляты рыбного белка), дрожжей и других одноклеточных (дезинтеграт дрожжевой биомассы, концентраты и изоляты дрожжевого белка) и т. д. Наиболее стандартный вид белкового сырья, с наилучшими функциональными свойствами — изоляты белков. Их производство растет наиболее быстро, и они практически полностью используются для питания.

Технические приемы, используемые для выделения белков, весьма многообразны и быстро совершенствуются. Получение чистых химических индивидуальных белков включает в себя как удаление небелковых примесей, так и разделение между собой собственно белковых компонентов. При этом необходимо учитывать некоторые особенности присущие белкам. К ним относится прежде всего способность белков подвергаться денатурации. Правда она во многих случаях обратима, однако эта обратимость не обеспечивается автоматически, а требует в каждом отдельном случае подбора специальных приемов[5].

Для предотвращения тепловой денатурации выделение белка проводят при низкой температуре, необходимо также избегать крайних значений pH.

Причиной денатурации может стать также применение органических растворителей, способных нарушить стабильность белка.

Особую опасность при выделении белков представляют содержащиеся в исходном материале протеолитические ферменты, даже если они присутствуют в следовых количествах. Для предотвращения протеолиза необходимо уже на ранних стадиях очистки включать операции, направленные на отделение протеиназ, прибавлять к смеси ингибиторы различных классов протеиназ. Очень важно проводить очистку белка быстро, что снижает опасность протеолиза и вероятность денатурации.

Казеин получают разными способами. Один из них состоит в том, что в молоко добавляют немного кислоты. Этим казеин освобождают от кальция, а затем его осаждают слабым нагреванием. Второй способ основан на добавлении сычужного фермента, вызывающего свертывание молока. Получаемый при этом творожный сгусток служит для изготовления сыров [6].

В промышленности для получения казеина молоко сначала центрифугируют, чтобы удалить содержащийся в нем жир, а затем добавляют в него слабощелочной раствор. После этого снова центрифугируют для отделения малейших следов жира и добавляют разбавленный раствор кислоты, чтобы добиться максимально полного выпадения казеина в осадок. Образовавшийся творожный сгусток промывают для удаления кислоты и высушивают при низкой температуре, поскольку казеин чувствителен к нагреванию.

Применения керамических мембран с размером пор 0.2 мкм позволяет выделить 95% казеинового белка  из обезжиренного молока в нативном состоянии. После концентрирования в 5-6 раз по объему концентрированный раствор, содержащий 15,4% казеина,  подается на сушку. Например, из 5 тонн обезжиренного молока получается 0,8 - 1 тонна сгущенного продукта, из которого после сушки получится около 190 - 230 кг сухого белка-казеина 70%-ной чистоты. Можно повысить содержание белка в сухом продукте, применяя диафильтрацию. Образующийся в процессе фильтрат представляет собой высокоочищенный раствор сывороточных белков без жира, бактерий и казеина. Он может быть использован для получения сывороточного белка высокой чистоты путем применения ультрафильтрации [7].

Продукты из соевых белков подразделяются на три группы, отличающиеся по содержанию белка: мука-крупа, концентраты, изоляты. На базе указанных видов белковых продуктов организуется производство и маркетинг текстурированной муки, концентратов и изолятов. Выпускаются модифицированные и специальные белковые продукты. Соевая мука и крупа производятся на мельничном оборудовании путем измельчения до определенного размера частиц обезжиренных или необезжиренных семян с последующим их просеиванием. В муке и крупе содержится 40-54% белка от общей массы продукта. Разные виды муки (крупы) отличаются по содержанию жира, размеру частиц и степени тепловой обработки. От интенсивности теплового воздействия зависят КРА, КДБ, активность ферментов липоксиге-назы, уреазы и ингибиторов протеаз. Соевые белковые концентраты изготавливаются из очищенных и обезжиренных соевых бобов (белых лепестков) путем удаления растворимых в воде небелковых компонентов (олигосахаридов, ферментов, минеральных веществ). Концентраты содержат 65-70% белка на сухое вещество. Соевые белковые изоляты являются наиболее очищенной формой белковых продуктов, так как содержат не менее 90% белка на сухое вещество. Белок экстрагируется из измельченного белого лепестка слабощелочным раствором (рН 8-11) с последующим осаждением в изоэлектрической точке и отделением в виде творожистой массы от олигосахаридов. Белковая масса промывается, нейтрализуется до рН 6,8 и сушится.

Назначение текстурированных белковых продуктов заключается в придании пищевым изделиям волокнистой или многослойной (кускообразной) структуры. После гидратации такие белковые продукты по внешнему виду и структуре напоминают мясо, птицу или морские продукты, выступая при этом в роли аналогов традиционных пищевых продуктов. Многослойная мясоподобная структура соевых белковых продуктов может формироваться с помощью термопластической экструзии. Основные стадии процесса включают: дозирование сырья → кондиционирование (увлажнение, нагревание) → варочный процесс → ламинарное течение (ориентация молекул белков) → формирование волокон → разрезание продукта на кски → сушка. В основе экструзии лежит процесс реструктуризации белка, заключающийся в том, что под влиянием температуры, увлажнения и механического воздействия макромолекулы его формируют вязкопластичную массу, выстраивающуюся в направлении сдвига, с образованием новых поперечных связей. В результате образуется многослойная объемная жевательная структура, пригодная для использования в качестве наполнителей или аналогов [8].

Производство изолятов и концентратов белка рыбы для пищевых целей получило развитие, в частности, в Скандинавских странах, США, Канаде, Англии, Индии, Перу и ПНР. С этой целью обычно измельчают филе или мороженную рыбу, обрабатывают раст-ворителем для удаления липидов, после чего белок переводят в раствор и очищают переосаждениом. В качестве растворителей для удаления липидов используют изопропанол, гексан, хлорированные углеводороды. Применяют также поверхностно-активные вещества или же осуществляют промывку большими коли-чествами воды, водными растворами солей или щелочей. Концентрат белка рыбы имеет высокую биологическую ценность [9].

Современное промышленное использование микроорганизмов для производства белка осуществляется в ферментерах, работающих по принципу хемостата. В среду с размножающимися микроорганизмами непрерывно подают водный раствор минеральных солей и применяемый в конкретном процессе органический субстрат. Культура подвергается перемешиванию, аэрированию и охлаждению. Выращенные клетки дрожжей оттеляют от водной среды сепарированием или фильтрованием. Разработаны и другие методы отделения биомассы, например флотация для концентрирования мелких бактериальных клеток. Их обычно промывают, концентрируют, после чего подвергают термической обработке при 80-90°С, приводящей к отмиранию клеток. Полученную массу высушивают, используя, как правило, распылительные сушилки [10].

3 Способы получения пептидов

Известно большое количество пептидов лекарственных средств. Их получают как синтетическими методами, так и выделением из животного сырья. Пептиды представляет собой неоднородную группу соединений, как по аминокислотному составу, так и по величине молекул. Являясь более сложными, чем аминокислоты, соединениями они выполняют более сложные функции: служат источниками аминокислот, азота, серы; принимают участие в различных процессах организма как регуляторы и посредники, могут служить иммуномодуляторами и иммуномедиаторами.

Существует несколько способов получения пептидов.

Химический синтез. Синтез пептидов определенной структуры, даже наиболее простых, требует предварительного временного блокирования (защиты) функциональных групп, которые не должны участвовать в реакции. Α-аминогруппу ацилирующей аминокислоты или пептида защищают так, чтобы блокирующую группировку после образования пептидной связи можно было отщепить, снять в достаточно мягких условиях, которые гарантировали бы целостность пептида. Для образования пептидной связи, которое при химическом синтезе, как правило, проводят в отсутствие воды, необходима активация карбоксильной группы. Ценным развитием ступенчатого синтеза пептидов является твердофазный метод синтеза пептидов, предложенный Р. Меррифилдом. С-концевую аминокислоту присоединяют к полимерной матрице сложноэфирной связью, используя, например, реакцию соли аминокислоты с активными бромметильными группами на поверхности поперечно сшитого полистирола. После образования сложноэфирной связи между С-концевым остатком и матрицей отщепляют защитную группу, обрабатывая полимер соответственно кислотой или амином. К освободившейся α-аминогруппе присоединяют аминокислоту, предшествующую С-концевой, используя для этого ангидрид защищенной аминокислоты или иной способ активации – реакцию в присутствии карбодиимида, пентафторфенилового эфира защищенной аминокислоты и т.п. Затем снова отщепляют защитную группу и повторяют цикл, присоединяя следующий аминокислотный остаток. Такие циклы можно повторять много раз, получая весьма длинные пептидные цепи [11].

Ферментативный синтез. Протеолитические ферменты в обычных условиях катализируют гидролиз пептидных связей. Однако могут быть подобраны такие условия, при которых равновесие оказывается сдвинутым в сторону образования пептидных связи. Так в концентрированных растворах бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина металлопротеиназы, например термозилин, катализирует образование пептидной связи между ними, причем продукт реакции выпадает в осадок в виде соли с ещё одной молекулой метилового эфира L-фенилаланина. Именно эта низкая растворимость продукта, которая выводит его из сферы реакции, смещает равновесие в сторону синтеза.

Еще один способ смещения равновесия в сторону синтеза – проведение катализируемой протеиназой реакции пептидного синтеза в органическом растворителе в присутствии малых количеств воды, достаточных только для гидратации фермента. Применяют при ферментативном синтезе и предварительную активацию одного из компонентов. Так, эфиры ацилированных пептидов в присутствии сериновых протеиназ быстро реагируют с аминокомпонентами – производными аминокислот или пептидов, образуя более длинные пептиды. Сдвиг равновесия в сторону синтеза в этом случае обеспечен активацией ацилирующего пептида за счет его превращения в сложный эфир [5].

В качестве ферментов для синтеза пептидов используются протеазы животного, растительного, микробиологического происхождения, например папаин, пепсин, а также металлопротеазы прозилин (Bacillus subtilus var.amyloliquefaciens), термозилин и термоаза (Bacillus thermoproteoliticus) [10].

Гидролиз природного сырья. При данном способе получения пептидов образуется смесь, состоящая из пептидов с различной длинной полипептидной  цепочки и свободные аминокислоты, поэтому данный метод чаще используется для получения аминокислот.

1.4 Способы получения аминокислот

Все аминокислоты имеют положительное влияние на организм. В качестве лекарственных средств используются глицин, глютамин, метионин и т.д.

Аминокислоты в различных сочетаниях входят в состав различных БАД, для улучшения общего состояния организма человека, могут входить в состав витаминных комплексов.

Для получения аминокислот используют следующие методы: гидролиз природного сырья, химический синтез, ферментативный синтез, микробиологический синтез.

Гидролиз природного сырья

Этот метод позволяет получить смесь аминокислот, и мало подходит для получения индивидуальных аминокислот. Продуктами полного гидролиза белков являются аминокислоты, частичного – аминокислоты и пептиды. В практических условиях преимущественно используют химические или ферментативные способы гидролиза. Однако в ряде работ применяются методы физического воздействия, которые так же обеспечивают разрыв пептидных связей. Это варианты термической обработки материала: длительное кипячение, нагревание паром, воздействие паром под давлением.

Для гидролиза используют практически любое белковое сырье. Многие виды сырья имеют географическую привязанность; другие – являются продуктами определенных производственных циклов. Так, гидролиз рыбных отходов практикуется в местах рыбного промысла и переработки рыбы: в России основные разработки проведены в Дагестанском НИИ питательных сред, Астраханском ТИ рыбной промышленности, Тихоокеанском институте рыбного хозяйства ТИНРО; за рубежом – в Японии, Великобритании. В Грузии предложены способы гидролиза чайного листа, плодов тунгового дерева; в Средней Азии – способы гидролиза хлопкового шрота. На предприятиях медицинской и биологической промышленности гидролизуют белковые  отходы производства сыворотки крови и сывороточных препаратов; на молокозаводах – казеин и белки сыворотки молока; на мясокомбинатах – отходы разделки мяса, колбасного производства и пр. [12].

Методы химического гидролиза:

- кислотный гидролиз используют как для полного гидролиза белков, так и для частичного. В практических условиях довольно часто применяют кислотный гидролиз, реже – щелочной.

Кислотный гидролиз проводят, преимущественно, с помощью минеральных кислот при повышенных температурах. Воздействием на белок высоких концентраций кислот при нагревании в течение достаточно продолжительного времени можно добиться полного его расщепления до аминокислот. Для гидролиза белковых материалов в практических целях используют меньшие концентрации кислоты и меньшую продолжительность обработки, отчасти возмещая их введением дополнительного фактора – давления. При получении препаратов для парентерального питания сернокислотный гидролиз чаще всего проводят 3– 5 ч при температуре 120 – 130оС и давлении 2 – 3 атм; солянокислотный – в течение 5 – 22 ч при тех же условиях.

Привлекательной стороной кислотного гидролиза является возможность получения глубоких гидролизатов в короткие сроки и образование бактерицидных условий в ходе процесса, что предотвращает бактериальную контаминацию и позволяет хранить гидролизат без нейтрализации продолжительное время.

Однако есть и отрицательные стороны: разрушается часть аминокислот, в том числе полностью триптофан, что сопровождается образованием летучих аминов и карбонильных соединений. В готовом гидролизате разрушившиеся аминокислоты компенсируют внесением синтетических: триптофана, лизина, метионина, цистина. Еще одним существенным недостатком кислотного гидролиза является высокая агрессивность среды, что приводит к быстрому износу оборудования.

-щелочной гидролиз, при этом способе гидролиза происходит рацемизация большинства аминокислот, а также разрушение аргинина и лизина. Щелочной гидролиз находит применение в ряде технологий как самостоятельный процесс, часть смешанного или начальная стадия обработки материала. Метод применяли при расщеплении казеина, в том числе для обогащения триптофаном кислотного гидролизата. Этот метод также используется для выделения витамина А из печени рыб, а также для получения белкового гидролизата из моллюсков [13].